胰蛋白酶酶解养殖大黄鱼脱脂鱼卵蛋白的工艺

周静，李惠芳，梁鹏, ，陈丽娇，程文健

1.福建农林大学食品科学学院（福州 350002）；2.福建省食品药品质量检验研究院（福州 350000）；3.福建省海洋生物技术重点实验室（福州 350002）

大黄鱼（Large yellow croaker，Pseudosciaena crocea）又称黄花鱼、黄瓜鱼、黄鱼等[1]。由2019年《中国渔业统计年鉴》可知，我国大黄鱼海水养殖的产量已达到197 980 t，其中福建省产量为165 378 t，占到全国产量的83.5%[2]。大黄鱼营养成分如蛋白质、不饱和脂肪酸等含量高，且通过简单的烹饪手法就可以得到佳肴[3]，因此在市场上很受追捧。大黄鱼鱼卵是大黄鱼加工过程中的主要副产物，其占鱼体总质量的15%～25%[4]。鱼卵中的蛋白质和脂肪含量都较高，如黑龙江茴鱼鲜鱼卵[5]和史氏鲟鱼鲜鱼卵[6]。此外还富含各种必需氨基酸等多种营养素[7]。

近年来对于水产食品加工副产物的利用研究越来越多，目前来说，对于鱼卵的加工方式主要还是不同种类的腌制。而传统的腌制过程不但会使鱼中的营养物质流失，还会生成对人体有危害的生物胺和亚硝酸盐等有毒物质[8-9]。因此有必要开发健康的鱼卵产品来满足市场需求以及避免原料的浪费。课题组前期采用响应面法优化了酶法以及乙醇提取法提取大黄鱼鱼卵油的工艺[10-11]，通过喷雾干燥法将大黄鱼鱼卵油制备成微胶囊并表征其性质[12]。课题组所进行的研究都表明大黄鱼鱼卵具有优良的加工利用价值。

此次试验以水解度和蛋白回收率作为检验指标，用胰蛋白酶酶解养殖大黄鱼脱脂鱼卵，在单因素试验基础上，通过正交试验优化酶解工艺，以期通过酶解获得大黄鱼脱脂鱼卵蛋白肽，为丰富鱼卵加工形式提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

养殖大黄鱼脱脂鱼卵；胰蛋白酶1∶250，酶活为5.0万 U/g；其他试剂均为分析纯。

K9840自动凯氏定氮仪、SH220N石墨消解仪，济南海能仪器股份有限公司；TGL-16台式离心机，上海安亭科学仪器厂；BS 224S型电子分析天平、PB-10型pH计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HH系列数显恒温水浴锅，上海江星仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

脱油脱脂鱼卵→酶解→灭酶（水浴锅中水浴15 min进行灭酶，温度为85 ℃）→酶解液→离心（离心机中离心20 min，转速为4 000 r/min）→上清液→测定相关指标

1.2.2 主要成分测定

水分、蛋白质、粗脂肪的测定方法参考GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》[13]中的直接干燥法、GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》[14]中的凯氏定氮法，以及GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》[15]中的索氏提取法。

1.2.3 水解度测定

氨基氮的含量和总氮的量分别采用甲醛滴定法和凯氏定氮法。水解度按式（1）计算。

1.2.4 蛋白回收率测定

将酶解液放置于室温条件下冷却，后放入转速为4 000 r/min的离心机中进行离心20 min，从而得到上清液。采用凯氏定氮法测定其总氮含量。蛋白回收的按式（2）计算。

1.3 胰蛋白酶酶解工艺研究

1.3.1 单因素试验

1) 酶添加量的确定。在pH 7.5±0.1、酶解温度50 ℃、料液比1∶10（g/mL）的条件下，将酶解液酶解4 h，并利用式（1）和（2）计算出水解度和蛋白回收率。

2) 酶解时间的确定。在酶添加量5 000 U/g、酶解温度50 ℃、pH 7.5±0.1、料液比1∶10（g/mL）的条件下，设置酶解1，2，3，4，5和6 h，以酶解大黄鱼脱脂鱼卵，从而确定最佳酶解时间。

3) 酶解温度的确定。在胰蛋白酶添加量5 000 U/g、pH 7.5±0.1、料液比1∶10（g/mL）、酶解时间4 h的条件下，设置酶解温度25，30，35，40，45，50，55，60和65 ℃，以酶解大黄鱼脱脂鱼卵，从而确定最佳酶解温度。

4) 料液比的确定。在胰蛋白酶添加量5 000 U/g、pH 7.5±0.1、酶解温度50 ℃、酶解时间4 h的条件下，设置料液比1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶10，1∶13，1∶16和1∶19（g/mL），以酶解大黄鱼脱脂鱼卵，从而确定最佳酶解料液比。

5) pH的确定。在胰蛋白酶添加量5 000 U/g、酶解温度50 ℃、料液比1∶7（g/mL）、酶解时间4 h的条件下，设置酶解pH 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0，以酶解大黄鱼脱脂鱼卵，从而确定最佳酶解pH。

以上试验所用的鱼均为干基。每组做3次试验，结果取3次试验的平均值。

1.3.2 正交试验

胰蛋白酶酶解正交试验因素及水平如表1所示。

表1 胰蛋白酶酶解正交试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 胰蛋白酶酶解工艺优化分析

2.1.1 酶添加量的确定

如图1所示，当胰蛋白酶的量超过5 000 U/g时，水解度降低。原因可能是反应中胰蛋白酶的浓度达到过饱和状态，由此反应变慢[16]。当酶添加量为6 000 U/g时，蛋白回收率达到最大。因此酶添加量选择5 000 U/g。

图1 酶添加量的影响

2.1.2 酶解时间的确定

如图2所示，超过4 h可以看到水解度逐渐降低，其原因存在3种情况：一是随着反应的进行，胰蛋白酶逐渐失活；二是反应产物在反应体系中不断堆积，使得整体反应被抑制；三是因为底物被耗尽[17]。并且超过4 h后，蛋白回收率也处于下降趋势。因此酶解时间选择4 h。

图2 酶解时间影响

2.1.3 酶解温度的确定

如图3所示，当温度超过50 ℃时，水解度开始下降。原因可能是温度过高导致胰蛋白酶的变性或者失活，有活性的胰蛋白酶减少，反应速率由此下降[18]。此外，蛋白回收率的峰值在温度45 ℃时到达。由于温度对水解度的影响更大，因此酶解温度选择50 ℃。

图3 酶解温度的影响

2.1.4 料液比的确定

如图4所示，随着料液比的增加，水解度呈先上升后下降的趋势，料液比较低时，反应物黏度较高，接触面积有限，反应被制约；随着料液比的增加，体系中反应物的浓度下降，酶解反应速率降低，水解度随之下降[19-20]。而蛋白回收率也在料液比为1∶7（g/mL）达到最大。综上所述，选择1∶7（g/mL）为最适酶解料液比。

2.1.5 pH的确定

如图5所示，随着pH的增加，当pH超过7.0后，水解度开始出现明显的下降。蛋白回收率也呈现先上升后下降的趋势。原因可能是反应环境酸碱性的变化导致胰蛋白酶的结构被破坏，有活性的胰蛋白酶含量较少，反应速度减慢，导致水解度和蛋白回收率也相应降低。因此，选择pH 7为最适反应pH。

图4 料液比的影响

图5 pH的影响

2.2 正交试验结果分析

由表2可知，5个因素在胰蛋白酶酶解过程中对水解度的影响顺序依次为料液比＞酶解温度＞酶解时间＞pH＞酶添加量，其中C、D、E三个因素的R值均超过1，即对胰蛋白酶的酶解效果有较大影响。由表2中K值可知，最优水平为A2B2C5D2E3，即pH为7.5、酶添加量为4 500 U/g、料液比为1∶9（g/mL）、酶解温度为45 ℃、酶解时间为4 h。此时水解度可以达到14.09%。

表2 正交试验结果

接表2

3 结论

此次试验通过单因素试验得出胰蛋白酶酶解大黄鱼鱼卵的pH在7.5时，蛋白回收率达到最大值；酶添加量在5 000 U/g时最为适宜；综合蛋白回收率和水解度2个指标以及成本考虑，选择4 h为最佳酶解时间，50 ℃为最佳酶解温度。此外，对试验进行正交优化，从而得到最佳工艺。由此为大黄鱼鱼卵酶解提供了较为理想化的试验数据，有利于大黄鱼鱼卵副产品的开发与利用。