酶解工艺对红花籽粕酶解液产物及特性的影响

吕凯波，龚乃超

武汉工商学院环境与生物工程学院（武汉 430065）

红花籽，中药称“白平子”，是红花（Carthamus tinctoriusL.）的种子[1]。红花籽中含油率在35%～40%之间，去油后红花籽粕无毒、无异味，粗蛋白质含量在20%～60%之间，其中含有18种人体所需的氨基酸，其中8种为含量较高的必需氨基酸[2]，蛋白消化率为77%[3-4]。红花籽粕还含有黄酮类、木脂素、糖苷、多酚以及苯丙烯酞-5-羟色胺等多种微量成分[5]，具有较高的营养价值和药用价值，极具商业开发价值和广泛应用空间。但目前一般作为廉价的肥料和饲料，利用率较低，其商业附加值不高。

利用食品级蛋白酶可直接获得安全性高、活性好的酶解产物[6]，从而得到更丰富的食品营养强化剂和添加剂，是目前提高植物蛋白附加值常用的方法。国内外通过酶解蛋白研究酶种类及其多肽分子量分布和产物功能特性的影响报道较多，希望通过酶改性，蛋白质在其乳化性、乳化稳定性等方面有显著改善，进而扩大其在食品领域内的应用[7]。目前国内对红花籽粕蛋白营养及提取方法、酶解工艺及制备抗氧化肽都有一定的研究基础，前期也尝试酶法水解籽粕为原料开发出多肽饮料[8]，此次试验期望通过不同酶解工艺得到酶解液，研究产物的稳定性、抗氧化性功能，为进一步开发红花籽粕资源提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红花籽粕粉末（压榨法提油后得到的红花籽粕，干燥粉碎后，过孔径0.425 mm筛）；中性蛋白酶（60 000 U/g，武汉市华生物技术有限公司）；木瓜蛋白酶（800 U/mg，源叶生物）；碱性蛋白酶（240 000 U/g，丹麦诺维信）；铁氰化钾（AR）；Tris（上海麦克林生化科技有限公司）。

HH-2恒温水浴锅（金坛市宏华仪器厂）；TG16-WS高速离心机（湘麓离心机仪器有限公司）；722E型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；RRH-A400型高速多功能粉碎机（上海缘沃工贸有限公司）；KQ-100E型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）JM-A2002型；电子天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 红花籽粕化学成分分析[9]

粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法；粗脂肪含量的测定采用索氏抽提法；水分含量的测定采用干燥恒重称量法；灰分含量的测定采用马弗炉灰化法；总糖含量的测定采用硫酸-酚法。

1.2.2 红花籽粕酶解液的制备

采用表1中的酶解工艺对红花籽粕进行水解。

表1 5种蛋白酶酶解工艺

其中，样品4超声波辅助酶解工艺：5%红花籽粕溶液在超声频率40 kHz、超声温度55 ℃条件下，超声20 min后，加入木瓜蛋白酶酶解2 h。以底物质量计酶活，于100 ℃水浴10 min灭酶，按4 000 r/min离心10 min，收集上清液，即为红花籽粕酶解液。

1.2.3 游离氨基氮含量测定

采用茚三酮比色法[14]。

1.2.4 可溶性蛋白含量测定

采用Folin-酚法[15]。

1.2.5 乳化性及乳化稳定性测定

采用浊度法[16]。

1.2.6 抗氧化性测定[17]

测定还原力、清除DPPH自由基能力和清除羟自由基能力。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 红花籽粕化学成分分析

由表2可知，红花籽粕中粗蛋白含量接近40%，将其作为廉价的肥料和饲料会造成蛋白质资源的极大浪费。采用1.2.2方法酶解籽粕，对酶解产物进行进一步研究。

表2 红花籽粕化学成分分析

2.2 酶解液游离氨基氮含量

以游离氨基氮质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，标准曲线如图1所示。回归方程为y=0.006 1x+0.000 2，R2=0.998 6（＞0.99），表明线性关系较好。

图1 游离氨基氮标准曲线

将样品测定的吸光度代入标准曲线中，计算酶解液中游离氨基氮的含量，结果如图2所示。样品3中的游离氨基氮含量最低，样品4和样品5最高，样品1和样品2次之；样品3的酶解液水解度最小，说明木瓜蛋白酶与中性蛋白酶混合使用，水解效果不突出；样品4和样品5游离氨基氮最高，表明红花籽粕在木瓜蛋白酶或中性蛋白酶酶解时较充分。样品1和样品4相比，样品4游离氨基氮含量更高，说明同一酶解工艺下，超声波辅助处理红花籽粕蛋白有利于提高酶解效果。

图2 酶解液中游离氨基氮的含量

2.3 酶解液可溶性蛋白质含量

以横坐标为蛋白质质量浓度，纵坐标为吸光度，标准曲线如图3所示。回归方程为y=0.052 6x+0.010 1，R2=0.997 9（＞0.99），表明线性关系较好。

图3 可溶性蛋白标准曲线

将样品测定的吸光度代入标准曲线中，计算酶解液中可溶性蛋白质含量，结果如图4所示。试验结果与游离氨基氮含量检测结果趋势一致，样品3中可溶性蛋白质含量最低，样品4和样品5最高，样品1和样品2次之。经过相关性分析：5种酶解方式下游离氨基氮含量与可溶性蛋白质含量呈极显著相关性，相关系数为0.92；这是由于酶解的作用，蛋白质长链被逐渐切断，可溶性蛋白大量增加，其中小分子的游离氨基氮也随水解程度加深而增加[18]，由此推测此时水解液中小分子物质中呈味物质也会不断增加。

通常认为水解液中可溶性蛋白在一定程度上可以表征蛋白质的水解度[19]。由图3和图4可知，游离氨基酸和可溶性蛋白趋势一致，说明不同蛋白酶酶解红花籽粕得到的酶解产物、酶解效果均有明显差异，其中超声波辅助木瓜蛋白酶酶解工艺最佳，其次为中性蛋白酶酶解工艺。

图4 酶解液中可溶性蛋白含量

2.4 酶解液乳化性及乳化稳定性

由图5可知，样品2乳化性最好，样品4和样品3次之，样品5和样品1最差；说明碱性蛋白酶水解红花籽粕后形成乳状液的能力最强，而水解度较高的样品4次之；这可能是因为水解度增加，多肽数量增加，疏水性氨基酸侧链外露，蛋白质分子中静电荷数量上升，蛋白质的乳化性在一定程度上增加；水解度较大时，当端基数目增加到一定程度后，电荷继续增大，亲水性也随着增加，吸附油滴能力下降，乳化性又降低[20]。

图5 酶解液乳化性和乳化稳定性

由图5可知，样品4和样品5乳化稳定性最好，样品2次之，样品1和样品3最差。采用超声波辅助木瓜蛋白酶酶解工艺的样品乳化稳定性最好；说明水解作用降低了分子的体积，增加了离子化基团的数量和分布，在形成乳状液中液珠间吸引作用小于其间的排斥作用，二者不易聚结，因此酶解液乳化稳定性较好[21]。

从乳化性和稳定性二者结合来看，样品4乳化性和乳化稳定性要明显好于样品1，说明超声处理对其有影响，超声波处理能改善蛋白质在水溶液中的分散效果和蛋白质的分子作用力。由图4和图5可知，不同蛋白酶酶解红花籽粕得到的酶解产物，其乳化性和乳化稳定性有明显差异。一般说来，水解液中含氮化合物及蛋白质含量越高，样品乳化稳定性也高。

2.5 酶解液抗氧化性分析

抗氧化肽具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基的功能，食用安全性高等优点，使其成为近年来国内外的研究热点[22-23]。如表3所示，样品4和样品2还原力最好，样品5次之，样品3和样品1最差，可能是因为在适当的水解度下，有较多的活性氨基酸或肽类被释放，具有较强的供氢或供电子的能力；样品1和样品4的DPPH自由基清除率最强，其次为样品2和样品5，样品3最差；对于羟自由基清除率，样品2和样品4较好，其他3种相差不大。综合对比3个抗氧化性指标，样品4最佳。这可能是因为在此条件下，水解度增加，具有抗氧化性活性肽段不断被暴露出来。

表3 酶解液抗氧化性

3 结论

以红花籽粕作为原料，对比不同酶解工艺下酶解产物的游离氨基氮、水溶性蛋白、乳化性及乳化稳定性、抗氧化性。结果表明：2.5 g红花籽粕在50 mL pH 6.5 PBS、4 800 U/g木瓜蛋白酶条件下，55 ℃超声处理20 min，酶解2 h，各项指标突出，此时游离氨基氮含量为535.52 μg/mL，可溶性蛋白含量为58.74 mg/mL，乳化性为1.26 m2/g，乳化稳定性为162.77 min，还原力为0.054±0.007，DPPH自由基清除率达（54.02± 2.8）%，羟自由基清除率达（35.16±1.4）%。以上研究结果显示，红花籽粕经酶解后有一定的营养价值、稳定性及抗氧化性，可作为植物源蛋白质类多肽类产品进行开发利用。