液态法发酵燕麦酒工艺优化

李建芳，李飞，陈龙，曲艳，周枫

信阳农林学院食品学院（信阳 464000）

燕麦属于禾本科一年生草本植物，喜冷凉湿润，生长期长，但是产量较低。在我国，燕麦主要用于家畜饲料与部分食粮[1]。燕麦营养价值较高，它的蛋白质含量12%～18%，脂肪4%～6%，淀粉21%～55%，籽实中维生素B1、钙和膳食纤维尤其丰富[2]，是谷物中较好的一种。燕麦具有抗氧化[3]、调节血糖血脂[4]、抗疲劳[5]的作用。燕麦中含有的β-葡聚糖在日常饮食中扮演着减少糖尿病并发症的角色[6]。燕麦还常作为辅料加入乳品或饮品中。

黄酒是我国众多酒中最为古老的一种饮料酒。它是以谷物为原料，通过多种酶与微生物的共同作用发酵而成的酒类[7]。黄酒的营养成分为低分子糖类、肽、氨基酸等浸出物，易被人体消化和吸收；其糖分能够直接吸收到血液中，产生能量；黄酒酒液中含有的经微生物作用过的活化水在80%～85%；黄酒中含有丰富维生素与微量元素。正是由于这些成分，黄酒具有增加食欲、恢复机能、帮助消化、促进血液循环的作用[8]。

试验大多用酒曲进行燕麦黄酒发酵。戴铭成[9]以炒制燕麦为原料，加入酒曲发酵酿制成燕麦黄酒，但燕麦粒与酒曲作用时间较长，发酵效率较低。罗文华等[10]通过粉碎、过筛并将其蒸熟的步骤，但相较于液态发酵，相同时间下发酵效果较差，发酵水平较弱。刘浩等[11]分析液态燕麦黄酒中液化、糖化、发酵的最佳因素，由于缺少糖化、发酵2个步骤的工艺研究，并不能确定试验是否达到最优效果。

试验以燕麦米为原料，将其隔水蒸熟后进行先糖化后发酵的液态发酵，通过单因素和正交试验对糖化、主发酵工艺进行优化，用理化指标评判发酵燕麦黄酒的品质，确定出最为适宜的糖化发酵条件，以期降低原料处理的时间与难度，扩展燕麦黄酒的液态发酵应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料与试剂

燕麦（市售，产地为河北张家口）；耐高温α-淀粉酶（30 U/mg，食品级，河南万邦实业有限公司）；糖化酶（食品级，北京鑫达食品添加剂有限公司）；柠檬酸（食品级，河南双腾实业有限公司）；活性干酵母（丹宝利酵母有限公司）；酒石酸钠、氢氧化钠、亚铁氰化钾、硫酸铜、亚甲基蓝（均为分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司）。

1.1.2 设备与仪器

孔径0.425 mm分样筛（上虞市五四食材仪器）；数显恒温水浴锅（HH-1型，上海梅香仪器有限公司）；生化培养箱（SHP型，上海山连实验设备有限公司）；电子万用炉（DL-1型，北京市永光明医疗仪器有限公司）；分析天平（FA2104型，上海良平仪器仪表有限公司）；恒温鼓风干燥箱（101-3型，北京市科伟永兴仪器有限公司）；双环火电磁炉（JYC-21HEC05型，杭州九阳生活电器有限公司）；双层蒸锅（BDY-Z613B型，德世朗厨具（上海）有限公司）、手持糖度计（WYT型，上海沪粤明科学仪器有限公司）；料理机（JYL-C012E型，九阳股份有限公司）；厨房秤（CFC001型，千团精工厨具（浙江）有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酒液化发酵工艺流程及操作要点

工艺流程：

操作要点：

1) 粉碎。燕麦通过料理机打碎，过孔径0.425 mm的网筛，置于塑封袋中储存。

2) 蒸煮。取20 g燕麦粉于250 mL锥形瓶中，隔水蒸30 min，将蒸好的燕麦冷却至30～37 ℃。

3) 液化。将蒸好的燕麦粉调整料水比1∶3.5 g/mL后加入5 U/g耐高温α-淀粉酶，放置在95 ℃水浴炉中液化40 min，在液化的同时进行搅拌。

4) 糖化。将完成液化的燕麦粉进行降温，在约65 ℃时用10%柠檬酸溶液调节至pH 4，加入糖化酶，在65 ℃下采用恒温浸出糖化法[12]糖化。

5) 发酵。将干酵母置于其体积的10～20倍的35～40 ℃温水中，活化20 min，再将糖化处理好的锥形瓶中加入等量无菌水，倒入活化好的酵母菌液，进行封口，置于发酵箱中进行发酵。

6) 抽滤。取发酵好的产物的上清液进行减压过滤，保留滤液。

7) 沉淀。将所得的滤液进行封口处理，在室温下静置1 d后利用纱布进行再次过滤。

8) 杀菌。将二次过滤后的滤液在72～75 ℃下处理15～240 s，进行巴氏杀菌（HTST）。

1.2.2 糖化发酵单因素试验设计

1.2.2.1 糖化酶添加量的影响

以20 g燕麦粉为原料，糖化温度65 ℃，糖化时间180 min进行糖化，分别添加0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%糖化酶，取2 mL稀释50倍后测定其还原糖度。

1.2.2.2 糖化时间的影响

以20 g燕粉麦为原料，糖化温度65 ℃，加酶量为0.3%进行糖化，分别以45，90，135，180和225 min进行糖化。取2 mL糖浆稀释50倍后滴定其还原糖度。

1.2.2.3 酵母添加量的影响

以20 g燕麦粉为原料，根据最佳的糖化工艺，加入与样品体积3.5倍无菌水，27 ℃温度下恒温发酵6 d，加菌量0.5%，0.7%，0.9%，1.1%和1.3%进行发酵，取滤液测定其可溶性固形物含量及pH。

1.2.2.4 发酵温度的影响

以20 g燕麦粉为原料，根据最佳糖化工艺，加入0.9%酵母菌，并添加为样品3.5倍的无菌水，分别以21，24，27，30和33 ℃下对其进行发酵6 d，取滤液测定其可溶性固形物含量及pH。

1.2.2.5 发酵时间的影响

以20 g燕麦粉为原料，使用最佳糖化工艺，在加菌量0.9%，27 ℃下，加水量为样品3.5倍的情况下分别发酵2，4，6，8和10 d，取滤液测定其可溶性固形物含量及pH。

1.3 糖化发酵正交试验

根据单因素所得结果确定最佳水平范围，使用L27(35)正交表，以感官评分为考察指标，设计五因素三水平的正交试验（表1）确定最佳糖化发酵工艺条件。

表1 正交试验表

1.4 感官评分方法

采用计分品评法，满分为100分。由20名生产专业人员从燕麦黄酒的色泽、香味、口感和酒体风格对液态法发酵的燕麦黄酒进行感官品评。针对液态发酵工艺所得出的燕麦黄酒的感官评价标准见表2。

1.5 理化指标测定方法

1.5.1 还原糖的测定

采用直接滴定法[14]，同法平行操作3份，取其平均值。每组的还原糖测定试验均重复3次，取其平均值。

1.5.2 可溶性固形物含量的测定

采用手持糖度计直接测量，对结果进行1位估读。重复平行试验10次，取其平均值。

1.5.3 pH测定

采用pH计在用pH 4缓冲溶液校准后直接测量，重复平行5次，取其平均值。

1.5.4 酒精度、总糖、总酸、微生物含量的测定

按照GB/T 13662—2018《黄酒》中的测定方法执行。

1.6 数据处理

获得的数据通过Excel 2010进行计算，正交试验结果的方差分析与极差分析通过Matlab软件进行。

表2 燕麦黄酒评分标准表

2 结果与分析

2.1 糖化酶添加量对糖化工艺的影响

糖化酶添加量对糖化效果的影响见图1。糖化酶添加量小于0.3%时，糖化酶添加量与糖化度成正相关关系；糖化酶添加量大于0.3%时，糖化度变化不大；糖化酶添加量0.5%时，与糖化酶添加量0.4%相比，糖化度略有下降但没有明显差异。综合进行考虑，选择0.2%，0.3%和0.4%较优糖化酶添加量。

图1 糖化酶添加量对糖化工艺的影响

2.2 糖化时间对糖化的影响

糖化时间对糖化度的影响见图2。0～180 min时，随着糖化时间延长，糖化度显著增大，在180 min后基本达到稳定。为保证糖化质量，选择135，180和225 min作为较优糖化时间。

2.3 酵母添加量对发酵工艺的影响

燕麦中蛋白质和脂肪含量高于常见的酿酒原料，较常见酒相比，燕麦黄酒发酵过程中蛋白质分解成小分子可溶性物质[15]，脂肪转化为酸。因此，在发酵过程中燕麦黄酒的可溶性固形物含量增加。

如图3所示，酵母添加量小于0.9%时，随着酵母添加量增加，可溶性固形物含量提高，酵母添加量大于0.9%后变化不大，趋于平缓。此时燕麦中的糖分发酵完毕，酵母的增加将不会影响可溶性固形物。

酵母添加量0.5%～0.7%时，pH不断下降，此时酵母菌依旧处于有氧呼吸而大量繁殖阶段，酵母添加量0.9%时，pH无下降趋势并基本达到稳定。故选择0.7%，0.9%和1.1%为较优酵母添加量。

图2 糖化时间对糖化的影响

图3 酵母添加量对发酵结果的影响

2.4 发酵温度对发酵工艺的影响

由图4可知，发酵温度不同，酿酒酵母的活性随之改变。起始阶段由于酵母菌代谢能力逐渐加强，糖类利用逐渐增多，可溶性固形物含量由高到低变化，发酵温度27 ℃时最终趋于稳定，燕麦中糖类物质基本使用完毕。发酵温度33 ℃时，可溶性固形物含量上升，此时发酵温度超过酵母最适温度，发酵速率下降。

pH在起始阶段同样不断降低，但在27 ℃时出现上升趋势，该温度下酵母菌代谢速率表现加快，但从后2组数据来看并未达到峰值。温度30 ℃时pH趋于稳定，与33 ℃相比变化不大。兼顾成本考虑，选择27，30和33 ℃为较优发酵温度。

2.5 发酵时间对发酵工艺的影响

由图5所示，随着发酵时间延长，由于酵母菌的利用，燕麦米中的蛋白质与脂肪转化增多，酒中可溶性固形物含量增加，发酵时间6 d时，基本达到稳定，即可溶性固形物基本不再产生。发酵时间10 d时，固形物含量降低，此时酵母的酒精发酵转为乳酸发酵，持续利用糖类，黄酒品质下降。

起先由于酵母菌大量繁殖，pH先降低，随后由于代谢pH增加，在6 d后基本达到稳定。故选择4，6和8 d为较优发酵时间。

图4 发酵温度对发酵结果的影响

图5 发酵时间对发酵结果的影响

2.6 糖化与主发酵工艺正交试验结果

根据单因素试验所得的合适水平范围，使用L27(35)正交表，以感官评分作为评价指标确定最佳的发酵-糖化组合（见表3），正交试验及其感官评分结果如表3所示。对其进行极差分析（见表4）与方差分析（见表5）。

糖化酶量、发酵时间对燕麦黄酒的感官均有显著影响（p＜0.05），其中糖化酶量达到极显著水平（p＜0.01），影响大小的顺序为糖化酶添加量＞发酵时间＞酵母添加量＞糖化时间＞发酵温度，综合分析得到最佳条件组合为A2B2C3D2E1，即糖化酶添加量0.3%、糖化时间180 min、酵母添加量1.1%、发酵温度30 ℃、发酵时间4 d的组合具有最好的感官评分。但是该组合并未出现在正交试验中。出现在正交试验中评分最高的组合为13，即糖化酶添加量0.3%、糖化时间180 min、酵母添加量1.1%、发酵温度27 ℃、发酵时间4 d的组合，感官分数为78分。故对两者进行对比。通过对过滤后的酒的色香味进行对比感官评价，认为组合A2B2C3D2E1更佳。

表3 正交试验结果表

表4 正交试验极差分析

表5 正交试验方差分析

2.7 最佳酿造工艺下燕麦黄酒的品质

通过最佳酿造工艺所得的产品呈米黄色，清亮透明，温和爽口，有明显燕麦香气，且回味有燕麦味。具体品质指标测定结果如表6。在最佳工艺下，各项理化指标均符合国家标准。

表6 产品品质理化指标对照表

3 结果、结论与讨论

3.1 结果

3.1.1 糖化结果

糖化酶添加量0.3%时，糖化度基本保持不变。此时燕麦粉中的淀粉基本被糖化，正交试验结果也有所体现。故确定0.3%为最优糖化酶添加量。

单因素结果和正交试验结果证明糖化时间180 min时，燕麦黄酒的品质最为优秀。为节约时间，选择180 min为最佳糖化时间。

3.1.2 发酵结果

单因素说明酵母添加量0.9%后，可溶性固形物含量及pH均保持不变。但正交试验表明，酵母量添加量1.1%时，所得的燕麦黄酒品质更为优秀。综合考虑，选择1.1%为最佳酵母添加量。

单因素试验结果说明酵母的最适温度应在27～30 ℃。正交试验方差分析和对比试验进一步证明，燕麦黄酒的发酵温度30 ℃时的质量优于27 ℃。因此，选择30 ℃为最优发酵温度。

发酵时间6 d时燕麦酒的糖分已达到充分发酵。但在选定的正交试验组别中，发酵时间在4 d的组别评分优于6 d的组别。在综合其余最优条件的燕麦黄酒发酵中，发酵时间4 d的产品表现更为突出。故选择4 d作为最优发酵时间。

3.1.3 结论

通过单因素与正交试验确定燕麦黄酒的最佳工艺条件，即最佳糖化条件为糖化酶添加量0.3%，糖化时间180 min。最佳发酵工艺为酵母添加量1.1%、发酵温度30 ℃、发酵时间4 d。在此条件下进行过滤杀菌得到燕麦黄酒。酒样理化指标分析符合国家要求。试验为液态化燕麦黄酒的发酵提供依据。

3.2 讨论

3.2.1 与传统发酵技术对比

与利用酒曲发酵燕麦黄酒的传统试验相比，虽然在糖化部分所采用的温度更高，但成品可现实其酿造（仅指糖化和主发酵）时间明显低于传统酿造工艺所需的30 d。发酵温度及酵母用量也低于部分文献的试验结论。

燕麦黄酒的液化法发酵很大程度上节省酿造时间，提高酿造效率。从能源消耗来看，液态法发酵更加节约能源，减少成本。

3.2.2 与已有结果对比

与刘浩等[11]的液态发酵燕麦黄酒相比，试验结果得出发酵时间对燕麦黄酒品质的影响，且设计糖化与发酵的综合正交试验。糖化方面影响：糖化酶添加量＞发酵时间。发酵方面影响：酵母添加量＞发酵温度。说明在燕麦黄酒的液态发酵过程中，发酵时间与酵母添加量比糖化时间起着更为重要作用；而糖化酶添加量在试验中应最为注意。