基于细胞表面特异识别的荧光标记小分子抗体的鉴定及其应用

张 静，熊 鸣，李小娟，马 伟，张达矜，乔媛媛

食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年有30万人死于食管癌。我国食管癌的发病率和死亡率也较高。由于早期食管癌缺乏临床症状并且特异性诊断标志也不明确，多数患者确诊时已为中晚期，导致治疗效果较差，5年生存率低于10%[1]。大量研究表明，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)可作为监测肿瘤生物学改变及复发转移的指标，实时监测指导肿瘤的进展、治疗及其预后评估[2,3]。噬菌体抗体库的筛选是获得人源单链抗体的重要策略[4]。利用噬菌体技术筛选纯蛋白、完整细胞的特异性抗体都有相关报道[5]。本课题前期应用噬菌体展示技术，针对完整肿瘤细胞高通量筛选富集，获得与肿瘤细胞表面抗原结合的单链噬菌体抗体，这些抗原可能成为肿瘤的靶点，以期为食管癌的诊断和预后提供更多的生物标志[6]。斑马鱼是基因和发育等方面研究的热门模式动物，可用来进行肿瘤监测和药物代谢等方面的研究。具有实验费用相对低、周期短、通量高等优势，因此本研究应用斑马鱼模型进行体内抗体与移植瘤聚集的示踪观察鉴定[7]，根据小分子抗体在动物体内与食管癌移植瘤的结合情况，从而确定筛选的肿瘤细胞抗体能否用于食管癌患者外周血CTCs的检测。同时课题组采用高通量蛋白质组芯片HuProtTM对小分子抗体可能结合的抗原蛋白表达谱进行筛选和探讨，以期得到更准确的抗原种类，筛选出更多的标志物用于肿瘤的早期诊断。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂 基于HuProtTM人类蛋白质组芯片(广州博翀生物科技有限公司提供)；磁场磁性细胞分离架/器MACS MultiStand(Miltenyi Biotec产品，Bergisch Gladbach,Germany)；抗CD45抗原磁珠，FITC-抗CK8/18/19、PE-抗CD45购自Miltenyi Biotec公司(Bergisch Gladbach, Germany)，细胞周期蛋白依赖性激酶2抗体(4A Biotech)，16%多聚甲醛，甲基纤维素，Triton-100购自Amersco Inc(Solon，OH，USA)； Tris，6孔板(Fisher Scientific，China)；1640培养液，胎牛血清，玻片购自Thermo Fisher Scientific公司(Troy，MI, USA)； DAPI、BSA(St Louis，MI, USA)；枸橼酸抗凝血采血管(ACD)购自BD公司(NJ, USA)。

1.2 斑马鱼移植瘤模型建立 野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。受精后2 d龄，饲养于28 ℃的养鱼用水中，实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证。红色荧光染料(CM-DiI)标记人食管癌细胞KYSE-170或KYSE-180，以显微注射的方式移植到斑马鱼卵黄囊内，建立斑马鱼人食管癌移植瘤模型。

1.3 荧光标记的小分子抗体与斑马鱼移植瘤聚集示踪 实验组30尾斑马鱼，设置空白对照组，阴性对照组，分别静脉注射不同浓度抗体、阴性对照抗体等。标记绿色荧光Alexa 488的抗体“488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”稀释不同浓度0.11C、0.33C和1.00C，分别注射到斑马鱼静脉中，阴性对照组同时注射不同浓度的“iF488-OA”，每尾注射量为10 nl；注射后利用荧光显微镜观察小分子抗体在斑马鱼体内的示踪。通过荧光强度、融合情况等评价抗体与斑马鱼体内食管癌细胞的聚集效应。

1.4 外周血采集 采集5例食管癌患者的外周血，每例7.5 ml，备用。

1.5 基于HuProtTM人类蛋白芯片的蛋白-蛋白互作鉴定抗体 采用HuProtTM蛋白质芯片对NFC20b和NFC70a两个抗体所结合的抗原种类进行鉴定。将标记荧光小分子抗体滴加在蛋白芯片上，使其与固定于芯片上的蛋白充分结合，清洗去除未结合的抗体。加入荧光标记的二抗(Cy3-anti-mouse IgG)37 ℃孵育，对荧光信号的扫描，根据荧光信号的亲和力强弱、数量判读阳性结果。

1.6 采用ELISA方法对抗原进行验证 分析蛋白芯片的结果，匹配NFC20b和NFC70a相关的抗原蛋白表达谱，用细胞ELISA法进行验证。培养KYSE-170、KYSE-180细胞，传代后接种培养板， 1h后离心弃上清，室温放置至细胞干燥；加入4%多聚甲醛固定40 min后， Triton-100细胞打孔备用。将抗细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)抗体1∶200稀释，加入细胞板中，孵育洗涤后，加入HRP标记的二抗(1∶1000稀释)，再次孵育洗涤，加入OPD底物液显色，1mol/L H2SO4终止，读取A490值。阴性对照为抗OA抗体，空白对照为PBS。

2 结 果

2.1 对斑马鱼体内食管癌KYSE-170细胞移植瘤聚集效应评价 标记了红色荧光的食管癌KYSE170细胞注射到斑马鱼卵黄囊中，形成移植瘤见图1A， “488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”在1 g/L浓度时，从4 h起至24 h，背主动脉、尾动脉和尾静脉中均能观察到抗体的分布；同时，“488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”在0.11 g/L、0.33 g/L和1.00 g/L浓度，从注射后4 h起，均能观察到卵黄囊中抗体与肿瘤细胞结合，其中488-NFC-70a抗体在9 h结合活性最高。表明两个小分子抗体可以通过血液循环分布到卵黄囊，对卵黄囊中的食管癌细胞有明显的结合聚集效应。而阴性对照品“iF488-OA”在各时间点与肿瘤细胞结合均不明显。图1显示的是两个小分子抗体在1g/L浓度下与食管癌KYSE-170移植瘤的不同时间点的聚集效应。

图1 488标记抗体对KYSE-170肿瘤细胞聚集效应

2.2 对斑马鱼体内食管癌KYSE-180细胞移植瘤聚集效应评价 标记了红色荧光的食管癌KYSE-180细胞注射到斑马鱼卵黄囊中，形成移植瘤。同2.1结果，图2显示 “488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”小分子抗体在1 g/L浓度下与食管癌KYSE-180移植瘤的不同时间点的结合聚集效应。

图2 488标记抗体对KYSE-180肿瘤细胞聚集效应

2.3 抗体检测食管癌患者外周血CTCs 采用Miltenyi免疫磁珠对5例食管癌患者的外周血进行负性富集分离，用Alexa 488标记的NFC20b抗体鉴定CTCs。检测出3例患者外周血有CTCs，检测率为60%。本研究所用抗体能够与食管癌患者CTCs结合，呈现绿色荧光，而白细胞表面抗原CD45染色阴性，核染色DAPI阳性(图3)。

图3 食管癌患者外周血CTCs的检测(×400)

2.4 基于HuProtTM蛋白芯片利用蛋白-蛋白相互作用鉴定单链抗体 利用高通量蛋白芯片实验筛选小分子抗体的抗原表达谱，根据实验具体情况，通过设置cutoff阈值来确定阳性蛋白，定义cutoff=2，即SNR>2为阳性蛋白。本次共筛选出与NFC20b抗体所结合阳性蛋白23个、NFC70a所结合的阳性蛋白28个。

2.5 初步验证蛋白芯片结果 采用ELISA法结果发现，KYSE-170、KYSE-180细胞能够与CDK2(0.89±0.06；0.68±0.04)抗体有效结合，而与卵清蛋白结合很低(0.06±0.00；0.04±0.01)，两者与食管癌细胞结合活性对比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

斑马鱼与人类基因同源性较高，具有繁殖能力强、体外受精发育、胚胎透明、成熟周期较短、个体小、能在显微镜下实时观察等诸多优势，广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选等方面。近年来，斑马鱼肿瘤移植模型已应用于肿瘤细胞迁移相关基因功能的研究与抗肿瘤药物的筛选，可在短时间为患者提供精准的个体化治疗信息。有学者在胃癌等细胞株构建模型用于肿瘤药物开发及临床前药物筛选的研究中发现，通过斑马鱼可直接观察抗癌药物对肿瘤细胞的影响，作为临床实验的初始筛选药物并制定个体化治疗方案的依据，为精准肿瘤学的发展提供有效平台[8,9]。

本研究基于人源噬菌体抗体库筛选得到食管癌细胞相关抗原的噬菌体抗体技术，改造其中2株抗体NFC20b和NFC70a，进行载体构建，进行原核细胞内抗体重组蛋白的表达。综合包涵体变性、复性、纯化等步骤，得到有生物活性的小分子抗体。小分子抗体标记荧光后，在斑马鱼体内进行抗体与移植瘤聚集的示踪[7,10]，观察此前筛选的小分子抗体在斑马鱼体内与食管癌移植瘤结合情况，确定本研究筛选的肿瘤细胞抗体在食管癌患者外周血CTCs的应用基础。蛋白质组芯片具有高通量、并行、快速分析的优势，在系统生物学研究中发挥着越来越重要的作用，适用于以蛋白质相互作用为基础的各种研究领域，在小分子药物靶向鉴定、单克隆抗体特异性筛选及自身抗体类标志物的筛选等方面应用广泛[11]。本研究为了更好地开发抗体应用，采用HuProtTM人类蛋白质组芯片对小分子抗体所作用的靶蛋白进行系统性筛选[12]。HuProtTM人类蛋白质组芯片包含20,000个人源重组蛋白质[13]，是目前世界上通量最高的蛋白质芯片，适用于全局性地进行蛋白-蛋白互作、蛋白-核酸互作、蛋白-小分子互作及蛋白翻译后修饰研究，借助此蛋白质组芯片技术，深入探讨这两个分子的作用。

经过对蛋白功能作用的分析，初步锚定细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)为其中一个抗体NFC20b所结合的抗原，为其应用到食管癌检出和治疗中提供依据。CDK2是细胞周期相关蛋白，细胞周期网络的异常与肿瘤的发生、发展密切相关，CDKs的异常表达使细胞周期紊乱、细胞增殖失控，最终发生癌变。很多肿瘤细胞系及胃癌、乳腺癌等肿瘤组织中都有CDK基因的扩增、突变和高表达[14,15]。以CDK为中心的细胞周期调控这一领域已成为细胞生物学和肿瘤生物学研究的热点。通过比较分析确定筛选得到的蛋白的可信性。

综上所述，本研究探索了一套寻找肿瘤标志物的方法，从大容量抗体库中筛选抗体，应用斑马鱼移植瘤模型对小分子抗体进行动物体内结合活性的验证，并用蛋白质芯片技术对其抗原筛选鉴定，得到与抗体直接相互作用的关键蛋白质，旨在从高通量筛选的新技术中寻找食管癌的标志物和药物作用靶点，为食管癌的临床诊断、预后监测及相关靶向药物开发提供了一定的思路[16，17]。下一步，将为其他小分子靶蛋白的发现提供更多的研究路线，为食管癌及其他实体瘤的检测及治疗方面的应用研究奠定基础。