外周血类黏蛋白1 样蛋白3 水平与过敏性哮喘患儿Th1/Th2平衡的关系

喻维，汪忠鸿，李冰，鲁焱，王仁杰，黄文娟

1 荆州市妇幼保健院，湖北荆州434000；2 长江大学第一附属医院 荆州市第一人民医院

过敏性哮喘（AA）是常见的一种过敏性疾病，病理表现为气道高反应性和气道重构［1-2］。AA 占成人、儿童哮喘的比例分别为50%、80%，AA 大多起源于儿童时期，且儿童哮喘经过早期规范管理和治疗可以逆转［3］，因此早期治疗对AA 患儿健康成长具有重要意义。近年研究显示，哮喘本质为气道慢性炎症，与中性粒细胞、T 淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等多种炎症细胞密切相关［4］。类黏蛋白1 样蛋白3（ORMDL3）基因为目前为止发现与儿童时期哮喘发生关联依据最充分的基因，主要表达于外周血淋巴细胞和肝脏，可通过增加未折叠蛋白反应和激活T 淋巴细胞参与AA 发生及发展［5-6］。研究发现，辅助性T 细胞亚群1/2（Th1/Th2）平衡状态与哮喘发生密切相关［7］。本研究分析AA患儿外周血ORMDL3 和Th1/Th2 水 平 变 化 情 况，探 讨ORMDL3 与Th1/Th2的关系，以期为AA防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2019 年10 月—2020 年5 月荆州市妇幼保健院收治AA 患儿64 例（AA 组），男34 例、女30 例，年 龄3～14（8.40 ± 2.52）岁；BMI 18～26（22.39 ± 1.89）kg/m2；均临床表现为不同程度的呼吸困难、喘鸣、咳嗽。纳入标准：①符合《中国过敏性哮喘诊治指南》（第1 版，2019 年）中AA 的诊断标准［8］；②年龄3～14 岁；③家属或监护人均知情同意参与研究；④无其他呼吸疾病者；⑤无呼吸道感染者。排除标准：①精神异常者；②其他心肺疾病者；③近1 周使用抗组胺、白三烯类药物及糖皮质激素者；④β2受体激动剂、糖皮质激素过敏者；⑤有哮喘家族史及自身免疫性疾病者。另选取48例同时期体检健康儿童为对照组，男20 例、女28 例，年龄3～14 岁（8.87±2.44）岁，BMI 17～27（22.98±2.27）kg/m2；与AA 组比较，其年龄、性别、BMI 无统计学差异（P均＞0.05）。本研究经本院伦理委员会批准实施。

1.2 血液标本采集 采集AA 组入院、对照组体检当天空腹外周静脉血6 mL，其中4 mL 加入EDTA 抗凝，转移至无菌PE 管；另2 mL 进行3 000 r/min 离心10 min，取上清液，置于无菌PE 管；均放入-80 ℃冰箱中待检。

1.3 血清IgE、嗜酸性粒细胞检测 取2 mL 待检血清，采用酶联吸附法（上海晶抗生物工程有限公司）测定血清IgE 水平，LH750 全自动血细胞分析仪（贝克曼库尔特生物科技有限公司）检测嗜酸性粒细胞并计算嗜酸性粒细胞比率（EOSR）。

1.4 肺功能指标检测 采用NIOX VERO 呼出分析仪（瑞典索尔纳Aerocrine 公司）检测呼出气一氧化氮（FeNO）；采用美能AS-407 肺功能仪（成都柏威斯科技有限公司）检测受检者安静睡眠时达峰容积比［呼气达峰容积/每分钟通气量（VPEF/VE）］、达峰时间比［呼气达峰时间/呼气时间（TPTEF/TE）］。

1.5 外周血Th1、Th2 细胞水平测定 取1 mL EDTA 抗凝外周血，RPMI1640 培养基（北京中科迈晨科技有限公司）等体积稀释外周血100 μL，加入10 μL 刺激剂，CO2培养箱（上海五相仪器仪表有限公司，CO2浓度5%；温度37 ℃）培养4～6 h。混匀，加入10 μL CD3-PC5、CD8-PC7，避光孵育15 min；加入固定液，再次孵育15 min。加入3 mL 磷酸缓冲盐溶液，3 000 r/min离心5 min，半径8 cm，弃上清。设置检测管和对照管，各管加入100 μL 破膜和溶血液，再加入10 μL IL-4-藻红蛋白单克隆抗体、IFN-γ-异硫氰酸荧光素单克隆抗体（上海安研商贸有限公司）避光孵育15 min。各管加入3 mL 磷酸缓冲盐溶液，3 000 r/min 离心5 min，弃上清。0.5 mL 磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，贝克曼库尔特MoFlo XDP 流式细胞仪检测Th1、Th2 细胞百分比。各样本每次检测1×104个细胞。

1.6 外周血ORMDL3 mRNA 水平测定 取3 mL EDTA 抗凝外周血，总RNA 抽提试剂（Trizol，北京索莱宝科技有限公司）提取外周血总RNA，TaKaRa 逆转录试剂盒转录合成cDNA。加入ORMDL3 上游引物5'-GCAAG-GCGAGGCTGCTAACCCACT-3'，下 游引物5'-GGGATAAGCACGCTCATCAGGG-3'，RT-PCR扩增。扩增条件：95 ℃预变性90 s，95 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40 次。各管设置3 个复孔，以GAPDH 做内参校正，上游引物5'-AGGTCGGAGTCAACGGAT-3'，下游引物5'-TCCTGGAAGATGGTGATG-3'，反应结束后得到各反应管Ct，2-ΔΔCt法计算外周血ORMDL3 mRNA相对表达量。

1.7 统计学方法 选用SPSS26.0 统计学软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数或百分比表示，采用χ2或Fisher检验；采用Pearson相关性分析、多因素Logistics回归分析AA的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血液及肺功能检测指标比较 AA组血清IgE、EOSR、FeNO 和外周血ORMDL3 mRNA、Th2 水平高于对照组，VPEF/VE、TPTEF/TE、Th1 水平和Th1/Th2低于对照组（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组血液及肺功能检测指标比较（±s）

表1 两组血液及肺功能检测指标比较（±s）

检测指标IgE（IU/mL）EOSR（%）FeNO（ppb）VPEF/VE TPTEF/TE ORMDL3 mRNA Th1（%）Th2（%）Th1/Th2 AA组（n=64）258.87±84.39 7.37±2.44 25.39±6.43 15.27±4.94 13.56±3.28 2.24±1.06 12.35±4.57 3.63±1.24 3.37±1.17对照组（n=48）43.90±10.36 5.38±1.20 18.65±5.18 25.57±7.44 19.39±4.22 1.01±0.23 16.79±5.64 1.70±0.52 9.84±2.52 t P 17.530 5.195 5.954 8.794 8.228 7.893 4.600 10.127 18.119＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

2.2 AA 患儿外周血ORMDL3 mRNA、Th1/Th2 的相关性及其影响二者的因素 Pearson 相关性分析显示，AA 患儿外周血ORMDL3 mRNA 与Th1/Th2呈负相关（r=-7.103，P＜0.05）。AA 患儿外周血ORMDL3 mRNA 与IgE、EOSR、FeNO 呈正相关，与VPEF/VE、TPTEF/TE 呈负相关；Th1/Th2 与IgE、EOSR、FeNO 呈负相关，与VPEF/VE、TPTEF/TE 呈正相关。见表2。

表2 影响AA患儿外周血ORMDL3 mRNA和Th1/Th2相关因素

2.3 AA 危险因素的Logistics 回归分析 以IgE、EOSR、FeNO、VPEF/VE、TPTEF/TE、ORMDL3 mRNA、Th1/Th2 为自变量，是否发生AA（是=1，否=0）为因变量，多因素Logistics 回归分析显示，IgE 和ORMDL3 mRNA 为AA 发生独立危险因素，Th1/Th2为保护因素（P均＜0.05）。见表3。

表3 AA危险因素的Logistics回归分析

3 讨论

哮喘是一组多种炎症细胞、气道结构细胞参与的气道慢性炎症性疾病，与环境、遗传、免疫因素等多种因素有关［9］。据调查显示，目前我国约有3 000万哮喘患者，其中14 岁以下城市儿童患病率高达3.02%，6岁以下更高［10］。反复喘息发作不仅给患儿身心健康造成了严重影响，也加重了家庭及社会的经济负担。目前尚不完全明确哮喘的发病机制，但大量研究证实，T 淋巴细胞在气道慢性炎症性中发挥重要作用［11］。Th1 和Th2 均来源于辅助性T 细胞亚群，Th1可分泌肿瘤坏死因子-β、IL-12、IFN-γ，Th2可分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-13。Th1 与Th2 为重要效应细胞，Th1 分泌的IFN-γ 能抑制Th2 功能和分化，Th2 分泌的IL-4 能抑制Th1 功能和分化［12］。生理状态下，Th1 和Th2 的功能和细胞数量是稳定的，若平衡被打破，则会引起疾病。研究显示，Th2 分泌的细胞因子能促进IgE 合成，诱导EOS 前体分化，促进EOS 浸润，是导致Th1/Th2 失衡及哮喘发生的基础［13］。有人通过抑制小鼠Th1 极化、增强Th2 极化发现，哮喘小鼠组织中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1和3表达明显提升，进一步证实Th1/Th2失衡会增加哮喘发生率［14］。本研究结显示，AA组外周血Th1/Th2 水平明显低于对照组，说明AA 患儿Th1/Th2 平衡出现明显破坏，机体免疫力受损；且AA 组外周血Th2 水平明显高于对照组，Th1 水平明显低于对照组，说明AA 发生与Th2 功能亢进和Th1功能低下有关［15］。

ORMDL3 为ORM 家族一员，位于人染色体17q21，序列高度保守。研究发现，1 型糖尿病［16］、类风湿关节炎［17］、系统性红斑狼疮［18］等自身免疫性疾病患者血清中ORMDL3 mRNA 呈高表达，说明ORMDL3 基因与免疫系统失调有关。研究发现，小鼠肺组织中ORMDL3 mRNA 呈低表达，而胎儿肺组织中ORMDL3 mRNA 呈高表达［19］，并进一步证实其与儿童哮喘发生有关。上调ORMDL3 mRNA 表达后，哮喘患者气道平滑肌的收缩和增殖能力明显提升，导致患者气道高反应性明显提升，病情加重［20］。本研究显示，AA 组外周血ORMDL3 mRNA 水平明显高于对照组，说明ORMDL3 mRNA 与儿童AA 发生有关。国内外多项研究证实，哮喘患者外周血中ORMDL3 mRNA、Th1/Th2 水平与EOSR 有密 切关系，二者能通过相互作用影响AA 患者，加重患者病情［21-22］。本研究显示，AA 组血清IgE、EOSR、FeNO水平明显高于对照组，VPEF/VE、TPTEF/TE 明显低于对照组，分析是AA 患儿存在明显的呼吸道免疫炎性反应，气道内附着大量黏性液体，增加了起到阻力，损伤肺功能。AA 患儿外周血ORMDL3 mRNA、Th1/Th2 水 平 与IgE、EOSR、FeNO、VPEF/VE、TPTEF/TE 具有明显相关性，ORMDL3 mRNA 为AA发生独立危险因素，Th1/Th2 为保护因素；外周血ORMDL3 mRNA 高表达可导致Th1/Th2 失衡，AA 发生风险增加。外周血ORMDL3 mRNA 变化与AA 发生的关系存在以下机制：①ORMDL3 表达产物能增加未折叠蛋白反应，其作为一种内源性炎症途径，可通过转录激活因子6、蛋白激酶R 样内质网激酶、肌醇酶细胞信号转导通路激活核因子-κB，活化巨噬细胞，导致气道慢性炎症发生；同时核因子-κB 还能调控绝大部分气道重塑相关的炎症介质和细胞因子，促进气道重塑［23］。②ORMDL3表达产物能导致内质网钙泵调节异常，产生内质网应激，促进气道平滑肌过度释放大量细胞因子，参与气道重塑［24］。③过度ORMDL3 表达能诱导IL-6、IL-8 激活磷酸化细胞外信号调节激酶/基质金属蛋白酶-9信号通路，促进气道重塑［25］。

综上所述，AA 患儿外周血ORMDL3 mRNA 水平明显升高，Th1/Th2 处失衡状态，为AA 发生的独立影响因素，可能是评估AA病情的良好指标。