药食兼用真菌蛹虫草的液体发酵培养条件优化*

苏 丹，杨智远，孙 蕊，张文浩，孙晓东，吕国忠**

（1.沈阳大学生命科学与工程学院，辽宁 沈阳 110044；2.大连民族大学生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116600；3.大连民族大学环境与资源学院，辽宁 大连 116600）

蛹虫草（Cordyceps militaris） 又可称之为北虫草、蛹草菌等，隶属于真菌门（Eumycota） 于囊菌亚门 （Ascomycotina） 核菌纲 （Pyrenomycete） 麦角菌科（Clavicipitaceae） 虫草属（Cordyceps），是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目（Lepidoptera） 夜蛾科（Noctuids） 昆虫蛹体上形成子座与蛹体的结合体[1]。野生蛹虫草的下部为虫身，上部为子实体。蛹虫草食用、药用价值很高，其蛋白质含量极为丰富，饱和脂肪酸如亚油酸含量较高，还含有丰富的矿物质元素、各种维生素、虫草素、虫草多糖等物质[2]，具有降低血脂、促进肠胃运动，帮助消化、预防血栓形成和动脉血管僵化、增强免疫力和抗炎等功效[2]。采用液体深层发酵方式培养，流动性大、培养条件较易人工调控、菌种生长繁殖快、生产成本较低、周期较短、可规模化量产等优势，具有很好的商业价值和广阔的市场空间[3]。虽然关于蛹虫草人工栽培的研究报道很多，但液体深层发酵的具体方式和条件不一，依然处在深化研究阶段，还需要大量的试验数据验证其可行性。通过对蛹虫草发酵相关资料进行分析，在前人研究蛹虫草发酵优化条件的基础上，以蛹虫草二级试验菌种为原材料，进行蛹虫草发酵条件优化研究，筛选出最适合蛹虫草菌种繁殖生长的培养条件，以期为蛹虫草规模化生产及蛹虫草的相关产品的研发提供基础数据[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备

上虞艾科LDX-30KBS高压蒸汽灭菌锅；上海双舜TG12M离心机；沈阳龙腾JD-4电子天平；托普云农GTOP-260B恒温培养箱；智城分析ZHJHC1109C超净工作台；安庆洁佳LZ-9200ZH电热干燥箱；上海晶坛SG-8020E振荡培养箱。

1.1.2 试验材料

蛹虫草二级试验菌种，为辽宁省微生物科学研究所提供。

1.1.3 药品试剂

磷酸氢二钾、葡萄糖、75%乙醇、维生素B1、氯化铵、蔗糖、硫酸镁等均为分析纯。

1.1.4 培养基

改良PDA培养基：土豆20%、MgSO40.1%、琼脂1.5%、蛋白胨0.5%、葡萄糖2%、K2HPO40.2%，蒸馏水1 L。

一级液体培养基：土豆20%、K2HPO40.2%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、MgSO40.1%、VB11片，蒸馏水1 L。

二级液体培养基：蔗糖30%、K2HPO40.2%、MgSO40.1%、蛋白胨1%、VB11片，蒸馏水1 L。

1.2 方法

1.2.1 液体菌种的制备

在改良PDA培养基中接种少量蛹虫草菌丝[5]。转移至恒温培养箱中，温度25℃，倒置避光培养约1周。在超净工作台中，挑选生长状况均匀、扩繁后的菌落，使用打孔器取直径1 cm、厚度0.2 cm的菌片，接种5片至一级液体培养基中。放入振荡培养箱中，22℃，150 r·min-1，避光振荡培养约1周。

1.2.2 单因素试验

1）pH对菌丝体干重的影响

制作二级液体培养基，将培养基的pH调节至6、7、8[6]，分别接种5片直径1 cm、厚度0.2 cm的菌片至二级液体培养基中，22℃，150 r·min-1，避光振荡培养。每组设置3组重复试验，分别在第3天、第5天、第7天测定各组菌丝体干重，确定最佳pH。

2）装液量对菌丝体干重的影响

制作二级液体培养基，选用250 mL三角瓶作为培养瓶。装液量设置3组处理，分别为80 mL、100 mL、120 mL。接种5片直径1 cm、厚度0.2 cm的菌片至二级液体培养基中，22℃，150 r·min-1，避光振荡培养。每组设置3组重复试验，分别在第3天、第5天、第7天测定各组菌丝体干重，确定最佳装液量。

3）温度对菌丝体干重的影响

接种5片直径1 cm、厚度0.2 cm的菌片至二级液体培养基中，150 r·min-1，避光振荡培养。分别在18℃、22℃、26℃下振荡培养1周。每组设置3组重复试验，分别在第3天、第5天、第7天测定各组蛹虫草菌丝体干重，确定最佳培养温度。

4）碳源对菌丝体干重的影响

分别以可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖为碳源，制作不同碳源的二级液体培养基，通过测定菌丝体干重，考察不同的碳源对菌丝体生长的影响[7]。每种碳源设置3组重复试验，浓度均为20 g·L-1。转速110 r·min-1，20℃，避光培养，分别在第3天、第5天、第7天测定各组蛹虫草菌丝体干重，确定最佳碳源。

5）氮源对菌丝体干重的影响

分别以蛋白胨、氯化铵、牛肉膏3种物质作为的氮源，制作不同氮源的二级液体培养基，通过测定菌丝体的干重，探究3种氮源对液体菌种生长的影响[8]。每种氮源设置3组重复试验，浓度均为1.5 g·L-1，110 r·min-1，20℃，避光培养，分别在第 3天、第5天、第7天测定各组蛹虫草菌丝体干重，确定最佳氮源。

1.2.3 正交试验

选择磷酸氢二钾和硫酸镁为无机盐。根据单因素试验结论，确定最佳碳源、氮源。设置4因素3水平正交试验，考察无机盐、碳源、氮源最佳组合用量[9]。碳源浓度控制在 10 g·L-1～30 g·L-1，变化梯度为 10 g·L-1；氮源浓度控制在 1.5 g·L-1～2.5 g·L-1，变化梯度为 0.5 g·L-1；KH2PO4浓度控制在 0.5 g·L-1～1.5 g·L-1，变化梯度为0.5 g·L-1；硫酸镁浓度控制在0.1 g·L-1～0.2 g·L-1，变化梯度为0.5 g·L-1[10]。正交试验设计表见表1。

表1 正交试验L9（34）Tab.1 Orthogonal experiment L9（34）

由表1所示，根据正交表设置的9组试验，每组3个重复。3组平行试验培养条件为20℃，110 r·min-1，暗培养，分别在第4天、第6天、第8天进行菌丝干重测定。

1.2.4 菌丝干重测定

发酵液于4 000 r·min-1下离心20 min。过滤收集菌丝体，于60℃下干燥至恒重，并称量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 pH对菌丝体干重的影响

pH对菌种的生长至关重要，过酸过碱都会导致菌种生长缓慢，甚至停止生长[11]。通过pH对菌丝体干重的影响研究，探究菌种液体发酵的最佳酸碱性条件。pH对蛹虫草菌丝体生长情况影响见图1。

图1 pH对菌丝体干重的影响Fig.1 Influence of pH on dry weight of mycelium

由图1看出，当pH为7时，菌丝体干重最大，说明在该条件下菌丝体生长更快、更多。pH为6或8时，菌丝体干重相对于pH为7时较小，说明在pH为6或8的条件下，菌种生长会受到抑制，生长速度减慢。经以上分析得出，液体发酵培养最佳pH为7。

2.1.2 装液量对菌丝体干重的影响

菌种的生长以及代谢过程与氧气息息相关。装液量关联着培养瓶中的含氧量，因而菌种的生长状况也会受到影响。装液量对蛹虫草菌丝体干重的影响见图2。

图2 装液量对菌丝体干重的影响Fig.2 Influence of liquid load on dry weight of mycelium

由图2看出，装液量为100 mL时，蛹虫草菌丝干重最大；装液量为80 mL时，菌丝体干重最小。装液量适当，培养瓶中氧气充足，培养液中溶氧量多，菌种对氧气利用率也高。在同一转速下，剪切力随着装液量的变化而变化，呈负相关，菌丝体生长不均匀；装液量太多时，培养瓶中氧气不足，不利于菌种的生长。以上分析可知，250 mL培养瓶进行液体发酵最佳装液量为100 mL。

2.1.3 温度对菌丝体干重的影响

蛹虫草菌丝体及其内重要物质的合成依靠酶的催化作用，而酶的活性与温度密切相关。温度对蛹虫草菌丝体干重的影响见图3。

图3 温度对菌丝体干重的影响Fig.3 Influence of temperature on dry weight of mycelium

由图3看出，培养温度为22℃时，所得蛹虫草菌丝体干重始终最大，在18℃时菌丝体干重最小，不同温度对菌种的生长产生不同的结果。温度过低，菌种活性会降低；温度过高，菌种生长受到抑制。以上分析可知，液体发酵最佳温度为22℃。

2.1.4 碳源对菌丝体干重的影响

碳元素是构成生物体最基本的元素，是构成细胞骨架的重要物质。不同碳源对菌丝体的生长速度、生物量大小、代谢产物的积累等方面产生不同的影响[12]。通过碳源单因素优化试验，测定菌丝体恒重，探究出蛹虫草液体发酵培养条件的最佳碳源。碳源对菌丝体干重的影响见图4。

图4 碳源对菌丝体干重的影响Fig.4 Influence of carbon source on mycelium dry weight

由图4可知，不同的碳源对蛹虫草液体菌种的生长发育存在显著差异。蔗糖作为培养基成份时，菌丝体干重最大，为0.716 g；葡萄糖作为碳源时处于中间（0.406 g）；可溶性淀粉为碳源时，菌丝体干重结果最小（0.290 g）。以上分析得出，以蔗糖作为碳源可以使蛹虫草菌丝体处于最佳生长环境，生长繁殖更快，由此选择蔗糖为最佳碳源。

2.1.5 氮源对菌丝体干重的影响

氮元素是菌丝体生长所需的重要元素。菌种对不同的氮源的利用率不同，其生长也会受到很大的影响。试验均选用有机氮作为氮源，考察不同氮源对蛹虫草菌种生长发育的影响，氮源对蛹虫草菌丝体干重的影响见图5。

图5 氮源对菌丝体干重的影响Fig.5 Influence of nitrogen source on dry weight of mycelium

由图5可知，应用SPSS 22.0进行数据分析得出，蛋白胨均与牛肉膏、氯化铵对蛹虫草液体菌种的生长发育存在显著差异（P＜0.05）。以蛋白胨为氮源时，菌丝体干重最大（0.704 g）；以氯化铵作为氮源时，测定的菌丝体干重最小（0.470 g）；牛肉膏作为氮源时处于中间（0.341 g）。因此由以上分析得出，以蛋白胨作为氮源可促进蛹虫草菌丝体的生长，产量更多，由此选择蛋白胨作为最佳氮源。

2.2 四因素三水平正交试验结果

采用正交试验的方法探究最有碳源、氮源、无机盐的最佳综合浓度比例。各试验组菌丝体干重结果见表2，正交试验结果见表3。

表2 正交试验菌丝体干重Tab.2 Dry weight of mycelium in orthogonal test

培养基中各物质使用量不同，菌种的生长会产生相当大的差异。由表2可知，由于摇床转速及温度控制不稳定，导致试验组1结果与其他2组结果差异较大，故舍弃第一组数据。由试验组2和试验组3可得出，试验组9的菌丝体干重最大，为1.035 g；其次是试验组7，为1.000 g，菌丝体干重最小的为试验组1，为0.600 g。由表3可得出，因素A得到的极差值最大，因此蔗糖对蛹虫草液体发酵的影响最大。因素D的极差最小，MgSO4对液体菌种生长影响最小。影响程度的顺序为：MgSO4＜K2HPO4＜蛋白胨＜蔗糖。以上分析可确定，蛹虫草液体发酵的最佳组合为A3B3C2D1，即蔗糖30 g·L-1、蛋白胨2.5 g·L-1、K2HPO41 g·L-1、MgSO40.1 g·L-1，所得菌丝体干重平均值为1.035 g。

表3 正交试验结果L9（34）Tab.3 Orthogonal test results L9（34）

3 结论

通过对蛹虫草二级菌种进行分离、培养、液体发酵并筛选出最适宜培养条件以获得最高的菌丝体干重，应用单因素试验得出最佳pH、装液量、温度、碳源和氮源；再采用正交试验确定了无机盐、碳源、氮源最佳配方，为蛹虫草后续人工培养的开发研究提供依据。以蛹虫草液体培养所得菌丝体干重为指标，通过4因素3水平正交试验结果，可得出不同因素对蛹虫草液体发酵培养影响度的顺序为：MgSO4＜K2HPO4＜蛋白胨＜蔗糖。结论如下：蛹虫草液体发酵培养最佳pH为7；最佳装液量为250 mL装液100 mL；最佳温度为22℃；最佳碳源为蔗糖；最佳氮源为蛋白胨。蛹虫草液体发酵培养基最佳组合浓度为蔗糖 30 g·L-1、蛋白胨 2.5 g·L-1、K2HPO41 g·L-1、MgSO40.1 g·L-1。