FLOT2在结直肠癌中的表达及其临床意义

李一凡 杜冀晖 赵 慧 李启凤 方丽珊 周瑜瑾 龚 慧

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化系统常见恶性肿瘤之一。据统计，2018年结直肠癌全球发生率为6.1%，居恶性肿瘤第3位，其病死率为9.2%，居恶性肿瘤第2位，总计超过180万例结直肠癌新增病例和881000例死亡病例，约占所有癌症死亡病例的1/10[1]。因此，有必要寻找更特异的结直肠癌分子标志物。

脂筏是细胞膜上直径约为10～200nm的微小区域，富含大量胆固醇、神经鞘磷脂等物质及caveolins(CAVs)、flotillin-1(FLOT1)、flotillin-2(FLOT2)、prohibitin (PHB)、stomatin(EPB72)-like 2(STOML2)等组成性蛋白，参与细胞膜运输及信号转导等诸多生理过程。近期研究发现，脂筏蛋白在多种肿瘤中表达上调，提示其在肿瘤发生、发展过程中扮演了一定角色。脂筏蛋白FLOT1在多种恶性肿瘤中表达上调并发挥调控作用[2]。FLOT2最近被确定参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程，例如乳腺癌、黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、肾癌和胃癌，这提示FLOT2可能在恶性肿瘤发生、发展中发挥一定作用[3～10]。然而，FLOT2表达水平与结直肠癌中表达水平、生物学功能和分子调控机制尚待阐明。本研究采用荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测FLOT2在结直肠癌中表达，探讨FLOT2表达水平与结直肠癌临床病理特征及患者生存预后之间的相关性，为进一步实验研究提供思路。

资料与方法

1.标本资料:收集2013～2014年在广东医科大学附属深圳第六医院确诊为结直肠癌的患者手术切除癌组织及相应癌旁非瘤组织标本，共4对。收集后立即放至液氮中保存。收集2003～2012年结直肠癌患者手术切除的癌组织石蜡切片，共157例，并将这157份标本纳入统计分析。上述标本由两名高级病理医生在石蜡切片和免疫组化染色后独立评估。所有结直肠癌患者术前均未接受化疗、放疗和免疫治疗。本研究经广东医科大学附属深圳第六医院医学伦理学委员会批准。患者临床资料详见表1。

2.主要试剂: 兔抗人FLOT2多克隆抗体购于美国Sigma公司，稀释浓度为1∶1000，免疫组化SP法试剂盒购于美国Thermo Fisher公司，DAB试剂盒购于北京中山金桥公司。

3.免疫组织化学染色: 所有标本用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋。免疫组化采用SP法，以PBS代替一抗作为阴性对照。样品经烘烤、脱蜡、水化，用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，用3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化氢酶，用血清封闭非特异性表位。在4℃冰箱孵育一抗过夜后，37℃孵箱孵育二抗15min。用二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显影后，苏木精复染、盐酸乙醇分化后，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，最后用中性树脂封片。

4.结果判断标准: FLOT2蛋白主要定位于细胞膜，从颜色为淡黄色至棕黄色。随机选取10个高倍视野进行计数(×400)，计算阳性细胞百分比，即在10个高倍镜视野下所有着色的细胞(即表达阳性细胞)与视野下所有细胞的比值。阳性细胞百分比评分的评分标准为:阳性细胞百分比<25%为0分，25%～50%为1分，>50%且≤75%为2分，>75%为3分。染色程度评分标准为：根据细胞染色程度，无染色为0分、淡黄色为1分、黄色为2分、褐色为3分。最终的染色评分为阳性细胞百分比评分×染色程度评分的乘积，即0、1、2、3、4、6、9分，以中位数3作为截断值(cut-off)，0～3分为低或不表达，>3分为高表达。

表1 结直肠癌患者的临床病理特征和FLOT2的表达

结 果

1．结直肠癌组织中FLOT2表达水平上调：通过荧光定量PCR检测4对CRC肿瘤及相应癌旁非肿瘤组织标本中FLOT2的mRNA表达，发现CRC组织中FLOT2 mRNA表达水平上调。患者A、患者B、患者C、患者D的CRC肿瘤组织标本中FLOT2的mRNA相对定量值与相应癌旁非肿瘤组织标本中FLOT2的mRNA表达相对定量值的比值分别是6.00、4.10、5.34、8.05，经Student′sttest检验,P<0.05，各患者的癌与癌旁FLOT2表达差异有统计学意义。其中，相对定量值指的是FLOT2 mRNA与内参基因GAPDH mRNA的比值。免疫组织化学结果显示，FLOT2阳性染色主要定位于细胞膜。FLOT2在4例结直肠癌组织中的表达均为阳性，高于相应癌旁非肿瘤组织(图1)。

图1 FLOT2在CRC石蜡组织切片中表达水平上调(×200)病理切片为二氨基联苯胺(DAB)染色后，苏木精复染。红色箭头指示FLOT2表达阳性细胞

2.FLOT2的表达水平与相应临床病理参数之间的相关性：免疫组化结果显示，FLOT2在正常的结直肠组织切片中表达极低，而在低度恶性组(Ⅰ/Ⅱ)中呈弱阳性表达，在高度恶性组(Ⅲ/Ⅳ)中呈强阳性表达(图2)。根据免疫组化评分将157例结直肠癌标本分为低表达组和高表达组。两组的对比结果分析显示FLOT2的表达强度与结直肠癌患者的Dukes分期(P=0.013)、临床分期(P=0.013)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.021)、M分期(P=0.016)、组织分化(P=0.016)和患者生存预后(P=0.025)显著相关，而与患者的年龄、性别和肿瘤位置无显著相关性(表2)。

图2 免疫组化检测FLOT2在癌旁非肿瘤组织和结直肠癌组织中的表达(临床阶段Ⅰ～Ⅳ)A、B.FLOT2在癌旁非肿瘤组织表达；C、D.FLOT2在肿瘤临床分期Ⅰ期结直肠癌组织表达；E、F.FLOT2在肿瘤临床分期Ⅱ期结直肠癌组织中的表达；G、H.FLOT2在肿瘤临床分期Ⅲ期结直肠癌组织的表达；I、J.FLOT2在肿瘤临床分期Ⅳ期结直肠癌组织表达。病理切片为二氨基联苯胺(DAB)染色后，苏木精复染

表2 FLOT2的表达水平与结直肠癌临床病理特征之间的关系[n(%)]

3.FLOT2的表达水平在结直肠癌患者中的预后价值：根据免疫织化评分结果，笔者将157例结直肠癌标本分为低表达组和高表达组，并对FLOT2高表达和低表达的结直肠癌患者进行Kaplan-Meier生存分析。Kaplan-Meier存活曲线显示FLOT2的表达水平与结直肠癌的总生存率显著相关，FLOT2高表达病例组的生存时间明显少于FLOT2低表达病例组，经Log-rank检验，两组之间比较差异有统计学意义(χ2=5.907，P=0.015，图3)。

图3 结直肠癌患者FLOT2低表达组和FLOT2高表达组的生存曲线

讨 论

配体与相应受体在脂筏区域的动态募集是诸多信号通路激活的关键。脂筏为NF-κB、WNT/β-catenin、EGFR (epidermal growth factor receptor)、TCR (T cell antigen receptor)、BCR (B cell antigen receptor)等信号通路的激活提供了分子募集激活平台。TNFR与TNF-α结合并转位至脂筏，募集RIP及TRAF2等，形成信号分子复合体，从而激活NF-(B信号通路[11]。研究证实脂筏是IL-1β、LPS和CD3/CD28等介导NF-κB信号通路激活过程中所必需[12～14]。脂筏区域内存在诸多与信号转导相关蛋白，如GPI锚联蛋白、G蛋白、G蛋白偶联受体和激酶等。脂筏和脂筏蛋白在细胞膜上执行正常功能，起到类似于转化器信号转导作用，如果某些脂筏蛋白表达增加，意味着转换器信号增多，过多信号促进肿瘤发生、发展。许多参与癌症发生、发展、转移的信号转导受脂筏调节。肿瘤发生、发展相关脂筏蛋白有多种，如caveolin-1(CAV1)、FLOT1和STOML2等。FLOT1可通过激活NF-κB和β-catenin信号通路发挥促癌作用。近期研究发现脂筏蛋白FLOT2在若干肿瘤中表达增高，提示其也可能有促癌作用。

本实验发现在结直肠癌组织中FLOT2表达水平显著增高。FLOT2在低度恶性组(Ⅰ/Ⅱ)中呈弱阳性表达，在高度恶性组(Ⅲ/Ⅳ)中呈强阳性表达。FLOT2的表达强度与结直肠癌患者的Dukes分期、临床分期、T分期、N分期、M分期、组织分化和生存预后呈显著相关，而与患者的年龄、性别和肿瘤位置无显著相关性。Kaplan-Meier存活曲线显示FLOT2的表达水平与结直肠癌的总生存率显著相关。

最近研究表明，FLOT2参与调节肿瘤干细胞(如胰腺癌干细胞)特征[15]。笔者发现FLOT2无表达或低表达的结直肠癌组织高分化比例偏高，FLOT2高表达的结直肠癌组织中分化和低分化比例较高，该发现提示FLOT2与肿瘤分化程度密切相关。该发现是否与FLOT2对肿瘤干细胞特征调节有关尚有待研究。FLOT2的表达强度与结直肠癌患者的Dukes分期、临床分期、生存预后显著相关，提示结直肠癌FLOT2表达水平有望成为预判结直肠癌患者预后的分子标志物。另外，笔者发现，FLOT2的表达强度与结直肠癌患者的T分期、N分期和M分期显著相关，FLOT2的表达强度与结直肠癌患者的年龄、性别和肿瘤位置无相关性，这些发现与前期报道一致[16]。笔者发现，FLOT2的高表达水平与结直肠癌的总生存率显著相关(χ2=5.907，P=0.015)，该结果也与前期报道结果一致[16～18]。

FLOT2高表达可促进结直肠癌的增殖和转移，但FLOT2在结直肠癌发生、发展过程中的分子机制尚未有明确结论[17]。有研究显示，与结肠直肠正常细胞比较，转移性SW620细胞衍生的脂质体中选择性富集脂质筏和脂质筏相关蛋白(CAV1、FLOT1、FLOT2、PROM1)，提示FLOT2可能与结直肠癌转移有关[19]。研究表明，抑制FLOT2可以通过调节Akt/FOXO信号转导抑制乳腺癌细胞的增殖[20]。FLOT2缺乏症可导致小鼠乳腺癌模型的肺转移减少[21]。FLOT2可通过与PLCD3相互作用参与鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭[22]。FLOT2促进鼻咽癌(NPC)转移，是转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)诱导的上皮-间质转化所必需的[23]。

FLOT2蛋白在结直肠癌中表达增高，其表达水平与结直肠癌临床分期、TNM分期、病理分化程度和患者总体生存率显著相关，因此FLOT2有可能成为评估结直肠癌患者预后的新的分子标志物。在未来研究中，FLOT2蛋白在结直肠癌发生、发展过程中的作用和机制仍有待于进一步研究。