甲状腺乳头状癌中PDK1、ZEB1及P-cadherin的表达和临床意义

薛栋　宋德坤　王平安　宋相孔　夏修良

【摘要】 目的：探討甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）、E盒结合锌指蛋白1 （ZEB1）和P-钙黏蛋白（P-cadherin）的表达情况和临床意义。方法：选取206例PTC和45例癌旁甲状腺标本，采用免疫组化检测PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白表达，并分析三个指标蛋白表达水平和临床病理各参数的关系。结果：PTC组织中PDK1、ZEB1阳性表达率分别为76.7%、72.3%，高于癌旁甲状腺组织的26.7%、28.9%（P<0.05）。P-cadherin在PTC组织中和癌旁甲状腺中的阳性表达率分别为22.3%、88.9%，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。PDK1、ZEB1及P-cadherin表达与TNM分期、腺体外侵及颈淋巴结转移有关（P<0.05）;Spearman等级检验分析，PTC组织中PDK1和ZEB1蛋白表达呈正相关（rs=0.476，P=0.031），PDK1和P-cadherin蛋白表达呈负相关（rs=-0.419，P=0.029），ZEB1和P-cadherin蛋白表达呈显著负相关（rs=-0.586，P=0.019）。结论：PTC中PDK1、ZEB1及P-cadherin蛋白的异常表达与PTC侵袭和转移密切相关，PDK1、ZEB1可能对PTC的诊断和治疗具有重要作用。

【关键词】 甲状腺乳头状癌 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 E盒结合锌指蛋白1 P-钙黏蛋白 免疫组织化学

[Abstract] Objective： To explore the expression and clinical significance of 3-phosphoinositide dependent protein kinase 1 （PDK1），zinc finger E-box-binding protein 1 （ZEB1） and P-cadherin protein in papillary thyroid carcinoma. Method： A total of 206 cases of PTC and 45 cases of adjacent thyroid specimens were selected， the expressions of PDK1， ZEB1 and P-cadherin were detected by immunohistochemistry， the relationship between three  indicaters protein expression and clinicopathological parameters was analyzed. Result： The positive expression rates of PDK1 and ZEB1 protein in PTC were 76.7% and 72.3%， they were significantly higher than 26.7% and 28.9% in paracancerous normal thyroid tissues （P<0.05）. The positive expression rates of P-cadherin in PTC and paracancerous normal thyroid tissues were 22.3%， 88.9%， the difference was statistically significant （P<0.05）. The differences of the expression of PDK1， ZEB1 and P-cadherin protein in PTC of TNM stage， extrathyroidal invasion and lymph node metastasis were all significant （P<0.05）. Spearman rank test showed significantly positive correlation was found between PDK1 and ZEB1 （rs=0.476， P=0.031）， there was negative correlation between PDK1 and P-cadherin （rs=-0.419， P=0.029）， the similar negative correlation was between ZEB1 and P-cadherin （rs=-0.586， P=0.019）. Conclusion： The abnormal expression of PDK1， ZEB1 and P-cadherin protein in PTC is closely related to the invasion and metastasis of PTC， PDK1 and ZEB1 may have an important role in the diagnosis and theraphy of PTC.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma PDK1 ZEB1 P-cadherin Immunohistochemistry

First-authors address： The Peoples Hospital of Binzhou City， Binzhou 256610， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.03.003

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是普外科工作实践过程中经常会接触到的一种甲状腺癌病理类型，占80%～85%[1]。最近几年PTC发病率呈明显上升态势，甚至有一部分微小乳头状癌病例早期就发生淋巴结转移[2]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）是细胞分子网络中一个重要信号通路，它参与细胞的过度增殖、转分化和衰亡等过程。3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（3-phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1）是一种重要的调节因子，激活PI3K/Akt信号，在转导信号过程中起着重要的作用[3]。PDK1主要包含两个分子结构域，分别为PH结构域（C端）和激酶结构域（N端），PDK1磷酸化Akt的苏氨酸（308位点）并激活PI3K/Akt信号，因此，PDK1与肿瘤细胞异常增殖、凋亡和侵袭转移都有关[4]。研究表明，急性髓细胞性白血病和乳腺癌中PDK1高表达，且与肿瘤不良预后有关[5-6]。上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是肿瘤侵袭转移过程中的重要事件。P-钙黏蛋白（P-cadherin）最初在1986年被发现，是EMT发生过程中的一个经典标志蛋白[7]。P-cadherin是一种细胞之间钙粘合蛋白，在维持正常细胞结构完整性、细胞形态、细胞增殖和转分化等过程中一直发挥重要生物学作用[8]。E盒结合锌指蛋白1（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1）是一个重要的转录调控因子，促进肿瘤侵袭转移[9]。有研究表明，ZEB1在肺癌组织中高表达，且与病理分级及淋巴结转移明显有关，ZEB1还是一个不良预后因素[10]。目前关于PDK1、ZEB1和P-cadherin在PTC中研究报道较少。本文重点探讨PDK1、ZEB1和P-cadherin与PTC临床病理参数的相关性，为探索PTC侵袭转移的分子机制提供一个新的思路。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月-2019年6月

滨州市人民医院206例PTC患者，男70例，女136例;年龄16～72岁，平均（44.1±6.4）岁;98例出现颈淋巴结转移，108例未出现颈淋巴结转移。纳入标准：符合甲状腺乳头状癌病理诊断标准;术中留取肿瘤组织或者癌旁组织。根据美国癌症联合委员会与国际抗癌联盟（AJCC）第八版进行TNM分期。排除标准：临床资料不完整;术前接受过放射治疗、化学药物治疗及免疫治疗等辅助治疗;合并其他组织器官癌变。选择同一时期45例癌旁正常甲状腺患者，男14例，女31例;年龄18～70岁，平均（42.2±5.2）岁。该研究已经滨州市人民医院伦理学委员会批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法 应用免疫组化方法（EnVision）检测PDK1、ZEB1及P-cadherin蛋白表达。鼠抗人PDK1单抗、鼠抗人ZEB1单抗和鼠抗人P-cadherin单抗采购于Santa Cruz公司，工作浓度为1∶200。EnVision试剂盒来源于Dako公司。阳性对照为已知阳性切片，阴性对照用PBS。

1.3 观察指标与判定标准 （1）比较PTC和癌旁甲状腺组织中PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白的表达情况;（2）分析PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白表達与PTC患者临床病理参数之间的关系;（3）分析PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白三者之间的相关性。阳性结果的判定：细胞出现黄色颗粒为阳性染色。PDK1蛋白定位在细胞质，ZEB1蛋白定位在细胞核，P-cadherin定位在细胞膜。先判定染色的强度：0、1、2、3分分别对应无色、淡黄、棕黄、棕褐色。然后计算阳性细胞百分数：0、1、2、3、4分分别对应≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%和>75%以上。最后将前两者乘积≥4分为免疫反应阳性，而<4分为免疫反应阴性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。Spearman用于相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC和癌旁甲状腺中PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白的表达 细胞质内出现棕黄或棕褐色为PDK1，见图1;细胞核出现棕黄色为ZEB1蛋白，见图2;细胞膜出现黄染为P-cadherin，见图3。PTC组织中PDK1、ZEB1蛋白的阳性率分别为76.7%、72.3%，而癌旁正常甲状腺组织PDK1、ZEB1蛋白阳性率分别为26.7%、28.9%，PTC中PDK1、ZEB1的表达率均高于癌旁甲状腺组织（P<0.05）。PTC组织中P-cadherin阳性率为22.3%，而在癌旁甲状腺中为88.9%，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 PDK1、ZEB1和P-cadherin表达与PTC患者临床病理参数间的关系 患者临床病理特征，如性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位和多灶性与PDK1、ZEB1和P-cadherin阳性表达均无明显相关性（P>0.05）;而PDK1、ZEB1和P-cadherin表达均与TNM分期、腺体外侵和颈淋巴结转移密切相关（P<0.05）。见表2。

2.3 PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白表达相关性 通过Spearman等级检验分析，PTC组织中PDK1与ZEB1蛋白表达呈正相关（rs=0.476，P=0.031），PDK1和P-cadherin蛋白表达呈负相关（rs=-0.419，P=0.029），ZEB1和P-cadherin蛋白表达水平呈显著负相关（rs=-0.586，P=0.019）。

3 討论

甲状腺癌在全球范围内均呈明显上升态势，目前居于我国女性恶性肿瘤的第四位[11]。近几年PTC病例越来越年轻化，且易发生引流区域的淋巴结转移，大约有70%的患者确诊时已发生淋巴结转移，因此关于侵袭转移的分子机制亟待解决。

PDK1可以通过多条途径调节蛋白激酶C的活性来激活Akt信号通路[12]。PDK1在喉癌组织中高表达，且其还与临床肿瘤分期、病理学分级及淋巴结转移有关，PDK1是喉癌患者生存预后的一个不良因素[13]。本研究结果显示，PTC组织中PDK1表达率高于癌旁组织（P<0.05），提示PDK1可能促进了PTC的发生发展。进一步还研究PDK1与PTC临床病理参数的关系，发现PTC组织中PDK1蛋白阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤部位和多灶性没有密切关系，而与肿瘤的TNM分期、腺体外侵和颈淋巴结转移相关（P<0.05），表明PDK1在PTC细胞侵袭转移中起重要作用。

ZEB1作为一个转录调控因子，在恶性肿瘤侵袭转移中发挥重要的作用[14-15]。ZEB1在肺鳞癌中高表达，且和纵隔内淋巴结、远处器官转移均有关，干扰ZEB1基因表达后，肿瘤细胞的增殖和侵袭力均较前明显下降[16]。新近的研究表明，膀胱癌和食管癌组织中均发现了ZEB1蛋白表达，且与临床预后明显相关[17]。乳腺癌中ZEB1高表达的患者容易出现化疗耐受，且还与Bcl-xL、cyclin D1呈正相关[18]。本研究结果显示，ZEB1在PTC中有高表达，且ZEB1表达率与TNM分期、腺体外侵和颈淋巴结转移相关（P<0.05）。另外，PTC组织中PDK1与ZEB1存在正相关，推测PDK1可能通过调控ZEB1表达促进PTC侵袭转移。

实体恶性肿瘤在侵袭转移过程中经常发生着上皮-间质转化（EMT）现象。P-cadherin通过本身的钙黏附作用来保持细胞间的紧密连接，一旦表达减少后导致黏附力下降，肿瘤细胞就会容易侵袭和转移[19]。EMT在PTC细胞侵袭转移过程中发挥着重要作用[20]。有研究发现肝癌组织中出现P-cadherin低表达，并且35例肝癌完全没有表达，P-cadherin还与肿瘤分期明显有关，体外细胞实验发现抑制P-cadherin表达，促进了肝细胞癌细胞增殖[21]。本研究结果显示，PTC中P-cadherin表达明显低于癌旁甲状腺组织（P<0.05）。P-cadherin阳性表达与患者TNM分期、腺体外侵及颈淋巴结转移及有关（P<0.05）。进一步研究还发现，PDK1和P-cadherin存在负相关，P-cadherin和ZEB1存在负相关。PDK1、ZEB1和P-cadherin在PTC中有异常表达的现象，且三者有相关性，提示三者参与了肿瘤侵袭转移过程。

综上所述，PTC中PDK1、ZEB1高表达伴有P-cadherin低表达，且三个指标均与TNM分期、淋巴结转移和腺体外侵明显相关。但是关于PDK1促进PTC侵袭转移的分子机制尚不明确，仍需要深入研究。

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（收稿日期：2020-10-12） （本文編辑：程旭然）