基于HPLC-Q/TOF-MS的经典名方苓桂术甘汤成分快速分析△

闵会，罗婷婷，印晓红，徐斌，查慧军，王建方，王如伟*

1.浙江康恩贝制药股份有限公司，浙江 杭州 310052；2.浙江省中药制药技术重点实验室，浙江 杭州 310052

经典名方是古方中药方剂的杰出代表，经过几千年仍应用广泛、疗效确切，具有明显的特色与优势，是中医药事业的瑰宝。为支持中医药发展、缩短中药方剂研发周期、降低研发成本，国家食品药品监督管理局发布《关于印发中药注册管理补充规定的通知》(以下简称《通知》)，《通知》要求“来源于古代经典名方的中药复方制剂，可仅提供非临床安全性研究资料，并直接申报生产。” 近年来，经典名方的开发研究成为中医药事业的热点之一，经典名方的中药制剂研发是新时期中药产业高质量发展的重要举措[1-2]。

苓桂术甘汤出自东汉张仲景《金匮要略》，其原处方为“茯苓四两，桂枝(今肉桂)、白术各三两，甘草二两，上四味，以水六升，煮取三升，分温三服。”主治中阳不足导致的痰饮水湿证[3]。苓桂术甘汤在现代临床医学应用广泛，主要用于心血管疾病、梅尼埃综合征、慢性支气管炎、盆腔炎和眼科疾病等[4]。苓桂术甘汤是中医“异病同治”思想的典型代表方之一，在健脾、利水、化痰方面有着显著效果，且不良反应较小，具有广泛的临床应用价值，收录于《古代经典名方目录(第一批)》[5-6]。

目前，对于苓桂术甘汤的研究文献主要集中于药理作用及临床应用方面，缺乏对其物质基础的研究。为快速高效分析苓桂术甘汤中化学物质成分，本研究首次采用高效液相色谱-四级杆/飞行时间串联质谱法(HPLC-Q/TOF-MS)技术建立快速分析方法，对苓桂术甘汤提取物进行快速分析鉴定，明确其物质基础，为其质量控制及药效物质基础等研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 6530型HPLC-Q/TOF-MS高效液相-质谱联用仪；Milli-QA10型纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试药

乙腈(Merck，色谱纯)；甲酸(Aladdin，色谱纯)；超纯水(自制)。

茯苓饮片(批号：190226)、肉桂饮片(批号：190215)、白术饮片(批号：190312)、甘草饮片(批号：190214)均购自杭州华东中药饮片有限公司。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1苓桂术甘汤提取物制备 取茯苓12 g、肉桂9 g、白术9 g、甘草6 g，加水1.2 L，煎煮至0.6 L，趁热滤过，减压浓缩至200 mL，置真空冷冻干燥器中干燥，得苓桂术甘汤提取物。

2.1.2供试品制备 取苓桂术甘汤提取物0.2 g，加水溶解，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，注入进样小瓶，即得。

分别取各味中药粉末，茯苓1.2 g、肉桂0.9 g、白术0.9 g、甘草0.6 g，各加水120 mL，加热回流1 h，放冷，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，注入进样小瓶，即得。

2.1.3色谱条件 色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈为流动相B，0.1%甲酸水溶液为流动相A进行梯度洗脱(0～10 min，5%～20%B；10～15 min，20%～23%B；15～30 min，23%～32%B；30～40 min，32%B；40～50 min，32%～38%B；50～60 min，38%～48%B；60～70 min，48%～65%B；70～75 min，65%～95%B；75～85 min，95%B)；流速：0.8 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.1.4质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)正、负离子，Auto MS/MS模式；离子扫描范围m/z50～1000，采集时间85 min；干燥气温度300 ℃，干燥气流速8 L·min-1，雾化气压力241 316.6 Pa，毛细管电压3500 V，裂解电压175 V，锥孔电压65 V，碰撞能30 V。

2.2 结果

按照上述条件对苓桂术甘汤提取物及各味药材饮片进行分析，得到苓桂术甘汤全方的总离子流(TIC)图，见图1。为了获得尽可能多的信息，本研究采用正、负2种离子全扫模式对其成分进行定性分析。

注：A.正离子模式；B.负离子模式。

根据一级质谱精确m/z找到化合物的准分子离子，再通过二级质谱图得到化合物的碎片离子信息，利用PubChem、HMDB、MassBank等数据库，根据不同种类化合物的化学键断裂规律及相关文献信息，对谱图中的化合物结构进行分析鉴定，共得到苓桂术甘汤中60个化合物。其中，来源于甘草43个、肉桂2个、茯苓3个、白术7个，2味或2味以上共有的化学成分5个，主要分为有机酸、黄酮、三萜皂苷、三萜酸、内酯等类成分，化合物具体鉴定结果见表1。

表1 苓桂术甘汤物质基础解析结果

2.2.1有机酸类 有机酸广泛存在于各类中药中，其药理作用主要表现在抗炎、抗氧化等方面[7]。本研究共鉴定出5种有机酸类成分，主要归属于白术、甘草和肉桂。峰8、11、12在负模式下准分子离子均为m/z353.090 2[M-H]-，分子式为C16H18O9，在二级质谱图中均能见m/z191特征碎片，是由母离子失去1分子咖啡酰基所得[M-C6H10O5-H]-，根据极性及出峰顺序，结合参考文献[8]鉴定峰8、11、12分别为新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸。峰35的准分子离子为m/z147.044 6[M-H]-，分子式为C9H8O2，在二级质谱图中可见m/z129，103碎片，结合参考文献[9]鉴定为肉桂酸。

以绿原酸(化合物11)为例，如图2所示，说明其裂解规律，其中m/z353.090 2为绿原酸的准分子离子峰m/z[M-H]-，裂解产生二级碎片离子为m/z191。

图2 ESI-模式下的绿原酸二级质谱图

2.2.2黄酮类 黄酮类化合物被认定为中药重要的药效物质成分，广泛存在于植物中。目前，已有上万个黄酮类成分被发现，其具有多样的生理活性，临床上常用于治疗癌症、肿瘤、心脑血管疾病及调节免疫等[10]。黄酮类化合物具有基本的C6-C3-C6结构，天然黄酮类化合物多与糖基结合，以黄酮苷的形式存在。因此，在二级质谱响应中，多呈现较高的黄酮苷元信号。本研究共鉴定17个黄酮类化合物，全部归属于甘草。如峰19，在负离子模式下其准分子离子为m/z417.120 4[M-H]-，分子式为C21H22O9，在二级质谱图中见明显m/z255的黄酮苷元信号，为准分子离子失去1β-D-葡萄糖基所得[M-C6H11O5-H]-，结合参考文献[9]鉴定为甘草苷。峰23在负模式下准分子离子为m/z459.132 2[M-H]-，分子式为C23H24O10，在二级质谱图中可见明显的m/z255黄酮苷元信号，为母离子失去1糖基所得[M-C8H13O6-H]-，结合参考文献[9]鉴定为6″-O-乙酰甘草苷。

以甘草苷(化合物19)为例，如图3所示，说明其断裂规律，其中m/z417.120 4为甘草苷的准分子离子峰[M-H]-，裂解产生二级碎片离子为m/z255。

图3 ESI-模式下的甘草苷二级质谱图

2.2.3三萜类 萜类化合物是自然界种类最多、分布最广泛的一类天然产物，以异戊二烯作为结构单元，通式为(C5H8)n。三萜类化合物多数含有6个异戊二烯单元，多为四环三萜或五环三萜，有游离存在于植物体中的，也有与糖结合成三萜皂苷的。本研究共鉴定出24个三萜类成分，其中包括3个归属于茯苓的三萜酸类和21个甘草中的三萜皂苷类。峰59在负离子模式下的准分子离子为m/z483.313 9[M-H]-，分子式为C30H44O5，在二级质谱图中明显找到m/z409，325，73的碎片离子，m/z409为母离子失去1-CH3CH2COOH基所得[M-CH3CH2COO-H]-，子离子继续失去1分子CO2得到m/z367碎片，其断裂规律符合三萜酸类裂解规律[11]，因此，鉴定化合物59为茯苓新酸B。同样的规律鉴定化合物60为茯苓新酸A，化合物54为16α，25-二羟基去氢齿孔酮酸(16α，25-dihydroxydehydroeburiconic acid)。

鉴定出归属于甘草的三萜皂苷类成分共21个，其与苷元结合的糖基易断裂，因此，在二级质谱响应中都呈现出强苷元信号。如峰36在正离子模式下的准分子离子为m/z839.405 3[M+H]+，分子式为C42H62O17，在二级质谱图中得到m/z487，469，451碎片离子，m/z469为母离子失去2个β-D-吡喃葡萄醛酸基所得[M-C12H18O13+H]+，再脱去1分子H2O得到m/z451[M-C12H18O13-H2O+H]+，结合参考文献[12]鉴定化合物36为甘草皂苷G2。

以茯苓新酸B(化合物59)为例，如图4A所示，说明三萜酸类裂解规律，其中m/z483.313 9为茯苓新酸B的准分子离子峰[M-H]-，裂解产生二级碎片离子为m/z409和73。以甘草皂苷G2(化合物36)为例，如图4B所示，说明三萜皂苷类裂解规律，其中m/z839.405 3为甘草皂苷G2的准分子离子峰[M+H]+，裂解产生二级碎片离子为m/z487，469和451。

注：A.ESI-模式下的茯苓新酸B；B.ESI+模式下的甘草皂苷G2。

2.2.4内酯类 本研究共鉴定出内酯类成分5个，其中包括白术内酯类4个和肉桂中的香豆素1个。峰58在正离子模式下的准分子离子为m/z233.153 3[M+H]+，分子式为C15H20O2，在二级质谱图中得到碎片m/z187，131和105。其中，m/z187为母离子失去1-CH2O2得到[M-CH2O2+H]+，m/z131为子离子内部发生重排反应，失去1-C4H8所得[M-CH2O2-C4H8+H]+，进一步失去1-C2H2得到m/z105碎片，结合参考文献[13]鉴定为白术内酯Ⅱ。香豆素属于苯丙素类化合物，天然苯丙素类化合物具有C6-C3结构，因其也具有内酯结构，二级质谱中裂解规律和白术内酯类似。峰27在正离子模式下的准分子离子为m/z147.044 0[M+H]+，其分子式为C9H6O2，在二级质谱图中得到碎片m/z103，为母离子失去1-CH2O2所得[M-CH2O2+H]+，结合参考文献[14]鉴定为香豆素。

以白术内酯Ⅱ(化合物58)为例，如图5A所示，说明其裂解规律，其中m/z233.153 3为白术内酯Ⅱ的准分子离子峰[M+H]+，裂解产生二级碎片离子为m/z187，131和105。图5B为香豆素(化合物27)的裂解规律，其中m/z147.044 0为香豆素的准分子离子峰[M+H]+，裂解产生二级碎片离子为m/z103和91。

注：A.ESI+模式下的白术内酯Ⅱ；B.ESI+模式下香豆素。

除了以上类别的化合物外，本研究还得到少数氨基酸、核苷酸、糖苷类化合物。

3 讨论

中药具有成本低、疗效好、不良反应小的优点，因其多成分、多靶点的特点对于慢性疾病的治疗具有显著优势。随着系统生物学、信息学、网络药理学等技术的不断发展，针对复杂性疾病的多靶点创新药研发是未来药物研发的重要途径。经典名方在几千年的历史中发挥着重要的临床价值，在中药新药研发中意义重大[15-16]。但也因其化学物质复杂，药效物质基础难以明确，有效性研究证据不足致使研发困难重重。HPLC-Q/TOF-MS具有高分辨率、高灵敏度的特点，能实现化合物复杂体系的快速分析。本研究为全面表征苓桂术甘汤的物质基础成分，基于HPLC-Q/TOF-MS技术，对液相流速、柱温、毛细管电压、碰撞能等多个参数进行优化，建立了苓桂术甘汤成分快速分析的方法；再通过一级质谱图找到化合物的准分子离子，然后再根据二级碎片信息，结合文献分析各类化合物的裂解规律，最终共鉴定60个化合物。该方法快速、准确、灵敏度高，为苓桂术甘汤的药效物质基础研究、质量控制等研究提供参考。但高分辨质谱技术仍然存在一定局限性，无法区分同分异构体，因此，通过该技术鉴定同分异构体比较困难。

本研究所鉴定的60个化合物，其中来源于甘草的42个、肉桂的2个、茯苓的3个、白术的7个，2味或2味以上共有的化学成分5个。因古代经典名方均为水煎煮提取，而茯苓中的三萜类成分和水不溶性多糖类成分难用水溶出，本方法完全还原古方，因此，在苓桂术甘汤提取物中检测到的茯苓特征成分较少。肉桂、白术中含有较多挥发油类成分，挥发油在煎煮过程中受火候、煎煮时间等影响，存在不同程度的损失，因此，肉桂和白术的特征成分也较少。本研究的意义在于提供一种快速分析方法，表征苓桂术甘汤的化学物质基础，为其质量控制提供参考，考虑到实际煎煮过程对挥发性成分的影响难以控制，因此，未专门针对挥发性成分进行补充研究。不同的煎煮工艺会影响各成分的溶出，因此，不同煎煮工艺下苓桂术甘汤的物质基础可能会存在差异，后期也会持续研究与关注。