稀土镧缓解玉米镉胁迫的生理生化反应及其转录组分析

温友伟，吴秀菊，李爱雨，刘 丹，王丽娟

(东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

近年来，随着冶炼、电镀工业、采矿业的蓬勃发展，伴随而来的是环境污染问题愈发严重，尤其是重金属污染问题[1]。镉以移动速度快、毒性强、污染面广成为所有重金属污染物中危害最严重的，被列为“五毒之首”[2]。有研究表明，排到环境中的镉大概有90%进入土壤，其中相当部分为农业土壤[3]。玉米是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，在重金属污染日益严峻的情况下，安全生产玉米具有重要意义。

稀土元素，位于元素周期表中的第6 周期第Ⅲ副族，包括原子系数从 57 到 71 的镧、铈等15 个元素及性质极为相似的钇、钪共 17 个元素[4]。我国最早的稀土农用开始于20世纪70年代。 近些年研究表明，农用稀土既是一种微肥，也是一种新型的植物生长调节剂，作为微肥可促进作物对矿质元素的吸收，作为生长调节剂可增强植物叶片的光合作用，提高叶绿素含量，增强抗病、抗逆能力，同时具有缓解重金属毒害的作用[5]。

RNA-seq也被称为转录组测序技术,其主要是应用高通量测序技术全面快速地得到所要研究样本的近乎全部的转录本,进而反映出它们的表达水平[6]。本研究在前人研究的基础上，以玉米为试验材料，研究稀土镧缓解玉米镉胁迫的生理生化特性以及通过转录组分析预测镧缓解玉米镉胁迫可能涉及的分子代谢通路。为后续针对稀土响应重金属胁迫的相关研究提供了候选分子资源。

1 材料和方法

1.1 供试材料与试剂

供试玉米(Zea maysL.)品种：黑龙江地区常见玉米品种先玉696(东北农业大学资源与环境学院孙彦坤老师提供)。

供试土壤：土壤购于黑龙江省哈尔滨市香坊区花卉市场，其基本理化性质为：pH值6.5，有机质7.35 g/kg，总N含量19.52 mg/kg，总P含量16.2 mg/kg，总K含量35.23 mg/kg。

稀土镧：来自上海国药试剂集团生产的氯化镧，纯度为分析纯。

重金属镉：来自天津市光复科技发展有限公司生产的氯化镉，纯度为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米种子的处理以及土壤的预处理 将土壤进行高温灭菌处理(121 ℃，30 min)，用蒸馏水配制镉溶液，将镉溶液均匀的喷施于高温灭菌的土壤上，使镉离子在土壤中的浓度达到0，5，7，10，15 mg/kg，选用直径为20 cm的花盆，每盆装1.5 kg喷施镉的土，静置7 d待用，每个处理重复3次。

将玉米种子用0.1%的HgCl2消毒10 min，然后用无菌水冲洗7次。选用直径15 cm的培养皿，皿内以双层滤纸为发芽床，每个培养皿中均匀放入50粒处理好的玉米种子，置于恒温培养箱中萌发，温度控制在25 ℃。待培养皿中的种子胚根长到3～5 cm，胚芽长到2～3 cm时，将其移种到事先处理好的土壤中，每盆3株。将其置于恒温温室中进行培养，温度控制在25 ℃。待玉米幼苗长出第3片真叶时喷施镧溶液，喷施标准以镧溶液滴液为限。幼苗生长期为一个月，到时取样。

1.2.2 镉浓度的选择 将发芽状态良好的玉米种子种植在含有不同浓度(0，5，7，10，15 mg/kg)镉离子的土壤中。本试验采用电导仪法测定质膜透性，采用MDA法测定植物组织膜脂过氧化。MDA含量采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒测定。通过这2个指标结合玉米生长量确定后续试验的镉浓度。

1.2.3 镧浓度的选择 配制10，20，40 mg/L氯化镧溶液，均匀喷布玉米叶片。本试验选取玉米幼苗叶片叶绿素含量以及叶片质膜透性2个指标，再结合喷施镧溶液对玉米幼苗生长量的影响作为评价指标，进行适宜镧浓度的筛选。叶绿素含量采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒测定。

1.2.4 喷施镧对镉胁迫玉米幼苗生理生化指标的影响 玉米幼苗生长量采用直接测量法。试验所测的叶绿素含量、MDA含量、抗氧化酶活性均采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒。

1.2.5 转录组测定与分析 对镧处理下镉胁迫玉米根部样品进行转录组分析。委托百迈克生物科技有限公司进行转录组测序。

2 结果与分析

2.1 镉浓度的选择

本试验采用电导仪法测定质膜透性(以鲜质量计)，采用MDA法测定植物组织膜脂过氧化。结果见图1。结果表明，在土壤Cd2+浓度为7 mg/kg或者浓度更高时，质膜透性显著上升。在土壤镉浓度为5 mg/kg或者浓度更高时，MDA含量(以鲜质量计)显著上升。玉米幼苗生长量见表1，在土壤镉浓度为7 mg/kg或者浓度更高时，幼苗生长量显著降低。最终选择7 mg/kg的土壤镉浓度作为后续试验浓度。

表1 镉胁迫对玉米幼苗生长量的影响Tab.1 Effect of cadmium stress on the growth of maize seedlings

2.2 镧浓度的选择

取玉米幼苗叶片叶绿素含量以及叶片质膜透性2个指标结合喷施镧溶液对玉米幼苗生长量的影响作为评价指标，进行适宜镧浓度的筛选。结果见图2、表2。喷施不同浓度(10，20，40 mg/L)的镧溶液，都能降低质膜透性(以鲜质量计)以及提高叶绿素含量(以鲜质量计)。其中质膜透性的降幅为1.06，1.42，0.69百分点。叶绿素含量的分别增长为20.73%，37.31%，10.88%。通过表2可以得到，在喷施20 mg/L镧溶液时，玉米幼苗的生长量提升最大。综上所述，选择20 mg/L为试验中喷施镧溶液的浓度。

表2 喷施镧溶液对玉米幼苗生长量的影响Tab.2 Effect of spraying lanthanum solution on the growth of maize seedlings

2.3 喷施镧对镉胁迫玉米幼苗生理生化指标的影响

从前面的试验中选出了试验所采用的镉浓度为7 mg/kg，镧浓度为20 mg/L。玉米幼苗结果见表3。测得在经过7 mg/kg镉处理的玉米幼苗地上部苗长降幅为21.77%，苗质量降幅为45.39%。根长降幅为47.45%，根质量降幅为50%。当喷施20 mg/L镧溶液时，镉胁迫玉米幼苗生长量的降幅明显变小，其苗长降幅为6.20%，苗质量降幅为29.75%，根长降幅为15.41%，根质量降幅为14.91%。叶绿素含量(以鲜质量计)见图3-A。可以发现单独镉处理玉米叶片叶绿素含量显著下降。单独喷施镧溶液，叶绿素含量显著上升。镉处理的基础上喷施镧溶液叶

表3 喷施镧溶液对镉胁迫玉米幼苗生长量的影响Tab.3 Effect of spraying lanthaunm solution on the growth of maize seedlings under cadmium stress

绿素含量比CK稍微低一点，但是比单独镉处理要高。MDA含量(以鲜质量计)(图3-B)的变化趋势与叶绿素含量正好相反。本试验测定了SOD、POD、CAT3种抗氧化酶的活性(以鲜质量计)，结果如图3-C-E所示，3种抗氧化酶在受到单独镉胁迫时，酶活性都会显著上升，而SOD酶活性的增幅要大于POD和CAT，表明SOD酶活性是玉米幼苗遭受胁迫时比较敏感的生物标记物。当在镉胁迫的基础上喷施镧溶液后，SOD、POD、CAT 3种抗氧化酶活性与单独镉胁迫时都显著下降，但是还是要比CK高，表明喷施镧溶液后，玉米幼苗体内活性氧的产生减少，玉米幼苗受到的镉胁迫得到缓解，但是不会恢复到正常的状态。综上所述，得知，在喷施20 mg/L镧溶液后，镉胁迫玉米幼苗得到缓解。

2.4 转录组测定与差异表达基因分析

2.4.1 测序统计与质量分析 从镉处理(7 mg/kg)和在镉处理(7 mg/kg)的基础上喷施镧溶液(20 mg/L)的玉米的根中分别提取RNA，构建样品cDNA文库，基于边合成边测序(Sequencing By Synthesis，SBS)技术，Illumina 高通量测序平台对cDNA文库进行测序，共获得37.64 Gb Clean Base，各样品Clean Base最低为5 789 701 560 bp，Q30碱基[7]百分比在94.43%及以上。数据见表4。

表4 样本转录组测序数据Tab.4 Sample transcriptome sequencing data

2.4.2 差异表达基因功能注释 对差异表达基因进行数据库的功能注释，各差异表达基因集注释到的基因数量统计见表5。从样本数据库中总共筛选到1 271条差异基因，有1 268条被注释到NR(Non-redundant protein sequence database)数据库中，1 013条被注释到Pfam(The database of Homologous protein family)数据库中，951条被注释到Swiss-Prot(A manually annotated, non-redundant protein sequence database)数据库中。

表5 注释的差异表达基因数量统计Tab.5 Annotated differentially expressed genes quantitative statistics

2.4.3 差异表达基因GO分析 GO(Gene Ontology)数据库是GO组织(Gene Ontology Consortium)于2000年构建的标准生物学注释系统，其目的是建立基因及其产物知识的标准词汇体系。在本次试验的差异基因中共有1 020个基因用于GO分类分析(图4)，分为50个功能亚类，从属于3个主要分支，即生物学过程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和细胞组分(Cellular component)。各自描述了基因产物可能行使的分子功能，以及所处的细胞环境和参与的生物学过程。在生物学过程中DNA整合(DNA integration)所占的比例最高，为15.66%。在分子功能中RNA聚合酶Ⅱ调控区序列特异性DNA结合(RNA polymerase Ⅱ regulatory region sequence-specific DNA binding)所占的比例最高，为8.14%。在细胞组分中膜的组成部分(Integral component of membrane)所占的比例最高，为19.32%。

2.4.4 差异表达基因COG分析 COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)数据库是基于细菌、藻类、真核生物的系统进化关系构建得到的，利用COG数据库可以对基因产物进行直系同源分类。在筛选出的差异基因中有428条差异基因用于COG分类，分别归类于COG分类的25个功能类别。在分类中，碳水化合物的运输和代谢障碍(Carbohydrate transport and metabolism)中表达的差异基因有61条，其数量是在所有差异基因的比例是最高的，接下来是脂质运输和新陈代谢(Lipid transport and metabolism)、仅一般功能预测(General function prediction only)、信号转导机制(Signal transduction mechanisms)，其差异基因数量分别为46,44，41。被归类到细胞内性腺激素的分泌和囊泡运输(Intracellular

trafficking, secretion, and vesicular transport)的差异基因只有1条。此外，在COG的25个功能分类中，还有3个功能没有没有筛选出差异基因，它们分别是RNA加工和修饰(RNA processing and modification)、染色质的结构和动力学(Chromatin structure and dynamics)、核结构(Nuclear structure)。差异表达基因COG注释分类统计见图5。

2.4.5 差异表达基因KEGG Pathway富集分析 分析差异表达基因在某一通路上是否发生显著差异即为差异表达基因的通路富集分析。差异表达基因KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析结果见图6。发现差异表达基因在淀粉和蔗糖代谢途径(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代谢途径(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、植物激素信号转导途径(Plant hormone signal transduction)和苯丙烷生物合成途径(Phenylpropanoid biosynthesis)富集最为显著，推测镧缓解镉胁迫可能和这4条通路有关。

3 讨论

镉作为一种非生命所必需的重金属，具有比较强的生物学毒性，被称为“五毒之首”[2,8-9]。本研究表明，镉对玉米幼苗具有明显的抑制作用，且随着镉浓度的升高，其抑制现象越明显，表现在生长量下降，抗氧化酶上升，膜脂过氧化程度(MDA含量)增加，叶绿素含量下降，与刘冰等[10]的研究一致。玉米作为粮食作物，在土壤重金属镉污染情况日益加剧的情况下，找到缓解玉米镉中毒的方法就变得越发重要[11-12]。

稀土作为一种缓释剂已经在农业中广泛推广[13]。大量研究证明，稀土元素在浓度适量的情况下可以提高植物种子萌发率, 增强植物抵抗逆境胁迫的能力和提高植物的抗病性[14-16], 本研究证明与镉处理相比，后喷施适宜浓度镧溶液玉米幼苗的生长量提高，叶绿素含量有所上升，MDA含量有所下降，抗氧化酶活性也有所下降，说明镉胁迫得到了缓解，这与黄晓华等[15]研究得到的稀土能增强植物抵抗逆境胁迫的能力一致。

随着科学技术手段的不断进步，高通量转录组测序技术已经成为植物相关研究必不可少的技术手段之一[17]。逆境是造成作物减产最主要的原因之一[18]，转录组测序技术可以了解作物与抗逆相关的分子机制，为培育出抗逆性强的作物品种提供分子基础。水稻[19]、小麦[20]、玉米[21]等重要的粮食作物通过转录组测序筛选得到了大量的胁迫响应基因，为作物丰产提供了保障。本研究通过转录组测序对差异表达基因进行分析，发现差异表达基因在淀粉和蔗糖代谢途径(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代谢途径(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、植物激素信号转导途径(Plant hormone signal transduction)和苯丙烷生物合成途径(Phenylpropanoid biosynthesis)富集最为显著，推测镧缓解镉胁迫可能与这4条通路有关。具体的缓解机制有待后续研究。

综上所述，喷施适宜浓度的稀土镧溶液可以在一定程度上缓解玉米幼苗受到的镉胁迫。其缓解的分子机制可能与淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、植物激素信号转导和苯丙烷生物合成途径有关。