牦牛SIRT7基因克隆及其在各组织和不同发情时期卵巢中的表达

杨柳青，殷 实,4,秦文昌，袁钰洁，李 键

(1.西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川 成都 610041；2.西南民族大学 畜牧兽医学院，四川 成都 610041；3.西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川 成都 610041；4.西南民族大学 现代生物技术国家民委重点实验室，四川 成都 610041)

Sirtuin7(SIRT7)是Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases, HDACs)中的一个成员[1]，最早从人脾cDNA文库中克隆出，定位于17号染色体长臂25区3带(17q25.3)[2]，其催化活性依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotine adenine dinucleotide, NAD+)[3-4]。SIRT7参与去乙酰化的过程分为2步：首先SIRT7将NAD+分解为烟酰胺(Nicotinamide, NAM)，然后将乙酰基从底物转移到NAD+的ADP-核糖基团上，形成2-O-乙酰-ADP-核糖和去乙酰化的底物[5-6]。SIRT7除了去乙酰化酶活性外，还具有其他的酶活性，如去琥珀酰化、去丁酰化、去豆蔻酰化等[7-8]。

SIRT7具有的酶活性使其在细胞内具有生物学功能的多样性。SIRT7通过去乙酰化组蛋白底物和非组蛋白底物，在细胞内参与DNA损伤修复、抑制癌细胞增殖及诱导细胞衰老等过程。SIRT7通过去乙酰化H3K18，降低DNA损伤位点H3K18Ac水平，促进损伤反应因子p53结合蛋白1(p53-binding proteins 1, 53BP1)与染色质的结合，阻止DNA复制，从而提高非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ) DNA修复效率[9]。SIRT7通过去乙酰化WD重复结构域77(WD repeat domain 77, WDR77)，干扰WDR77与精氨酸甲基转移酶5(Protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)的相互作用，从而抑制癌细胞的增殖[10]。SIRT7还能将核仁磷酸蛋白(Recombinant nucleophosmin 1, NPM1)去乙酰化，增强人体抑癌基因(P53)的转录活性并诱导细胞衰老[11]。除了去乙酰化，SIRT7可将H3K122去琥珀酰化，参与调节DNA修复中发生的染色质重塑过程，从而维持基因组的稳定性[12]。

Gao等[13]的研究发现，在敲除SIRT7的小鼠卵母细胞中GA结合蛋白转录因子β1(GA binding protein transcription factor beta1, GABPβ1)乙酰化水平升高，ATP的含量与对照组相比减少约40%，且线粒体中ROS的水平显著升高，表明缺少SIRT7的卵母细胞中线粒体的供能功能受损[13]。此外，他们还发现在肥胖小鼠的卵母细胞中，SIRT7蛋白水平较正常小鼠低，上调SIRT7的表达能够保护卵母细胞免受母体肥胖相关的氧化应激和减数分裂缺陷的影响。SIRT7通过去乙酰化Ras相关的核抗原(Ras-related nuclear antigen, RNA)，调控核因子kB p65(Nuclear factor-kappa B p65, NF-kB p65)从核中输出，从而抑制卵巢颗粒细胞对凋亡的拮抗作用[14]。这些结果表明,SIRT7通过去乙酰化在卵巢中发挥着重要作用。

牦牛(Bosgrunniens)作为青藏高原的主要畜种，具有较高的经济价值，然而其繁殖力较低，流产率较高等缺点限制了牦牛的生产性能[15]。目前，有关SIRT7的研究多集中在人和鼠上，鲜有家畜上的研究。本试验以成年牦牛为研究对象，克隆了牦牛SIRT7基因的整个CDS区并预测了其所编码蛋白结构和功能。同时检测了SIRT7基因在牦牛各组织和不同发情时期卵巢中的表达。本研究为深入研究SIRT7基因在牦牛生殖繁育过程中的作用提供一定的数据支持。

1 材料和方法

1.1 样本采集

试验所使用的组织样本均来自于四川盛龙食品有限公司的屠宰场。采集成年牦牛(3～5岁)的肝脏、乳腺、大肠、肾等组织及其处于卵泡期(卵巢内有许多囊状卵泡)、红体期(卵泡外膜破裂,卵泡腔充满血液,颜色呈鲜红色或紫红色)、黄体期(黄体突出于卵巢表面,呈黄色)的卵巢，来源于3头牦牛的同一种组织被视为生物学重复。所采集的样本经生理盐水清洗后，用经消毒的外科手术剪剪成小块装入2 mL冻存管中，标记好样品名称及采集时间后立即置于液氮罐中带回实验室。

1.2 主要试剂及仪器

TRIzol购自Invitrogen公司；Premix TapTMDNA聚合酶、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit(100)胶回收试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司；NovoScript®Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(gDNA Purge)反转录试剂盒购自Novoprotein；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 总RNA提取及cDNA制备

TRIzol法提取组织总RNA。核酸分析仪测定RNA浓度及纯度，A260/280比值在1.8～2.0的RNA样品可进行后续试验。按照反转录试剂盒说明书步骤对合格RNA样品进行反转录，合成的cDNA于-20 ℃保存。反转录体系20 μL:RNA样品1 μL，gDNA Purge 1 μL， 2×NovoScript® Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 10 μL，RNase Free Water 8 μL。反应条件：50 ℃孵育30 min，75 ℃孵育5 min，4 ℃保存。

1.4 引物设计及合成

克隆引物的设计依据GenBank中登录的黄牛SIRT7基因序列(登录号：XM_019981494.1)并通过Primer Premier 5设计完成(表1)。定量引物的设计依据GenBank中登录的黄牛SIRT7(登录号同上)及ACTB(登录号：AY141970.1)并通过NCBI中的Pick Primers设计完成(表1)，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.5 PCR扩增及克隆

以牦牛黄体组织cDNA为模板，通过普通PCR进行SIRT7基因的扩增克隆。PCR反应体系25 μL：模板cDNA及上、下游引物各1 μL，Premix TapTMDNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，61 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃ 7 min。完成凝胶电泳检测后，在紫外下，将目的条带切割置于1.5 mL离心管中，使用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的回收。回收后的DNA产物，与载体pMDTM19-T于16 ℃连接15 h后，转化至DH5α感受态细胞中，经LB固体培养基(Amp+)于37 ℃培养12 h后，再于LB液体培养基(Amp+)中接种挑取的白色单菌落，摇床培养6 h后，通过PCR对菌液进行鉴定，阳性菌液交由生工生物(上海)股份有限公司测序。

1.6 实时荧光定量PCR

牦牛各组织(其中卵巢组织为处于卵泡期的卵巢)及不同发情时期卵巢的cDNA为模板，ACTB为内参基因，实时荧光定量PCR检测SIRT7mRNA的表达量。PCR反应体系为15 μL：模板cDNA 及上、下游引物各1 μL，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，ddH2O 5.5 μL。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；以0.5 ℃/10 s的速度从62 ℃增温至98 ℃。每个样本重复3次。

1.7 生物信息学分析

通过DNAMAN 9对测序所获得的牦牛SIRT7基因序列进行拼接，并进行同源性比对。使用NCBI中的在线软件ORF Finder确定开放阅读框，并翻译成氨基酸序列。使用DNASTAR 7.1和ExPASY工具包中的SWISS-MODEL分别预测蛋白的二级结构和三级结构。利用ExPASY工具包中的ProtParam、SignaIP 5.0 Sever、TMHMM 2.0、NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0 Server、NetNGlyc 1.0 server分别分析蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、O-糖基化位点、N-糖基化位点。

1.8 统计分析

2-ΔΔCt方法分析qRT-PCR结果，SPSS统计软件分析差异显著性。结果以平均值±标准误差形式表示，P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 牦牛SIRT7基因克隆及同源性分析

PCR扩增获得的目的产物条带长1 376 bp(图1)，与设计的SIRT7克隆引物结果一致。SIRT7的开放阅读框大小为1 203 bp，编码400个氨基酸(图2)。开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

牦牛的SIRT7基因序列与其他9种哺乳动物的SIRT7基因序列进行同源性比对(表2)，结果表明，牦牛SIRT7基因序列与黄牛SIRT7基因序列的同源性最高，为99.4%，与其他物种的SIRT7基因序列同源性也都在90%以上。系统进化树(图3)结果表明，牦牛与黄牛的亲缘关系最近。

表2 牦牛与其他物种SIRT7基因的同源性对比Tab.2 Alignment of SIRT7 gene sequences between yak and other species

2.2 牦牛SIRT7蛋白结构及功能预测

SIRT7蛋白相对分子质量为45.04 ku，分子式为C1943H3176N614O583S18，等电点、脂肪族系数、不稳定系数分别为9.63，77.33，61.9。SIRT7蛋白氨基酸组成如表3，所含氨基酸中Arg、Leu、Glu含量较高，分别为11.5%，11.0%，8.2%。SIRT7蛋白中带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)和带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)数量分别为68，49个，由此可知，SIRT7蛋白整体上带正电荷。总平均亲水性为-0.664，该蛋白为亲水性蛋白。无信号肽和跨膜结构域。

SIRT7蛋白存在38个磷酸化位点，其中12个苏氨酸位点，22个丝氨酸位点，4个酪氨酸位点(图4)。此外，SIRT7蛋白还含有24个O-糖基化位点。

表3 牦牛SIRT7蛋白氨基酸组成Tab.3 The amino acids composition of yak SIRT7 protein

牦牛SIRT7蛋白二级结构(图5)由α-螺旋(47.4%)、β-折叠(29.7%)、β-转角(15.7%)及无规卷曲(7.2%)组成，三级结构预测结果与二级结构相一致(图6)。

2.3 牦牛SIRT7 mRNA组织表达谱

以肌肉为参照，SIRT7mRNA在牦牛各组织中广泛表达(图7)，表达量最高的组织为肾，且显著高于其他组织(P<0.05)，乳腺、大肠、肝脏、心脏中表达量次之，卵巢及肌肉中表达量相对较低。

2.4 牦牛SIRT7 mRNA在不同发情时期卵巢中的组织表达谱

以卵泡期卵巢为参照，对不同发情时期卵巢中SIRT7mRNA的表达量进行分析，结果表明，SIRT7mRNA在牦牛的卵泡期、红体期和黄体期卵巢中的表达量呈逐渐上升的趋势，且各时期之间的表达达到显著水平(P<0.05)，黄体期的表达量最高(图8)。

3 讨论与结论

SIRT7蛋白是一种沉默调节蛋白，可将启动子上已乙酰化的组蛋白H3K18和H3K36去乙酰化，而H3K18和H3K36的去乙酰化均与基因组稳定性有关[16-18]。除了组蛋白去乙酰化外，SIRT7还可与各种非组蛋白(P53、U3-55k)相互作用，从而参与调控人类衰老和癌症等多种生理及病理过程[19-21]。已有相关研究证实SIRT7的去乙酰化与小鼠的卵巢功能具有密切的联系[13]。基于目前对牦牛SIRT7基因的研究较少，本试验克隆了牦牛SIRT7基因，预测了其所编码蛋白的结构和功能，并检测了SIRT7mRNA在各组织及不同发情时期卵巢中的表达。

本试验成功克隆了牦牛SIRT7基因的CDS区。序列比对结果表明，牦牛SIRT7基因序列与黄牛SIRT7基因序列的同源性最高，为99.4%，与其他物种的SIRT7基因序列同源性也都在90%以上，表明SIRT7基因在哺乳动物进化的过程中高度保守。磷酸化及糖基化预测结果表明，牦牛SIRT7蛋白有多个磷酸化及糖基化位点，说明该蛋白可能受到翻译后修饰的调控。SIRT7在其C-末端区域(氨基酸344-348)具有细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)磷酸化位点，有研究发现，SIRT7在有丝分裂过程中通过CDK1-cyclinB途径直接或间接被磷酸化，磷酸化后导致SIRT7 C-末端区域的构象改变，SIRT7磷酸化后的状态降低了抗体对SIRT7 C-末端区域的反应性[22]。目前，关于SIRT7蛋白的糖基化功能未见报道。本研究针对牦牛SIRT7蛋白的预测结果对于未来研究SIRT7蛋白的功能具有一定的帮助。

本试验检测了SIRT7mRNA在牦牛各组织中的表达。结果表明，SIRT7的mRNA广泛表达于各组织，在肾及乳腺中表达较高。SIRT7通过去乙酰化集合小管外侧膜上的钾氯协同转运蛋白4(Recombinant potassium chloride cotransporters 4, KCC4)，维持肾脏集合管室的pH值的平衡[23]。乳腺的泌乳功能与雌性动物的生育直接相关，已有研究表明，在奶牛乳腺上皮细胞中过表达SIRT7，可显著提高乳脂合成关键因子过氧化物酶增殖体激活受体γ(Peroxisome proliferators-activated receptorsγ,PPARγ)和固醇调节元件结合蛋白1(Sterolregulatory element-bindingproteinl, SREBP1)的表达[24]。而关于SIRT7是否调控牦牛的肾脏及乳腺发育这一科学问题还有待进一步研究。

本试验结果发现，在牦牛卵巢中，卵泡期、红体期、黄体期SIRT7mRNA的表达量呈明显的升高趋势，其中黄体期表达量最高，提示SIRT7可能在牦牛黄体的形成过程中发挥重要作用。牦牛黄体形成过程中在细胞层面最主要的变化是细胞胞质中线粒体数量增多及脂质代谢增强[25]。SIRT7的第388位精氨酸(R388)被蛋白精氨酸甲基转移酶6(Protein arginine methyltransferases 6, PRMT6)甲基化后，抑制了SIRT7的H3K18去乙酰化酶活性，R388的甲基化可促进线粒体的生物发生[26]。有研究发现，SIRT7通过与SIRT1结合而阻止SIRT7发挥去乙酰化酶活性，从而促进脂肪的合成[27]。肝脏特异性敲除SIRT7的小鼠，即使喂养高脂肪的食物，小鼠体质量保持不变，说明SIRT7的存在与脂质的合成有关[28]。以此推测SIRT7可能通过调控颗粒细胞黄体化过程中线粒体的合成和脂质代谢进而影响牦牛的卵巢功能。关于SIRT7在卵巢活动中的具体作用机制有待于进一步研究。

本研究成功克隆了牦牛SIRT7基因，开放阅读框大小为1 203 bp，编码氨基酸400个，牦牛SIRT7蛋白是一个无信号肽和跨膜结构域的亲水性蛋白，其编码区在生物进化过程中高度保守，且具有多个磷酸化和糖基化位点。SIRT7mRNA在肾及乳腺中高表达，在牦牛卵巢中，卵泡期、红体期、黄体期SIRT7mRNA的表达量呈持续升高的趋势，其中黄体期表达量最高。本试验为研究SIRT7在雌性生殖系统中的作用及提高牦牛的繁殖性能提供一定的理论支持。