血浆相关生化指标的检测与奶牛妊检阴性的预警意义

2021-05-07孟德超宋玉锡曹浩张桐宁赵畅白云龙夏成

黑龙江八一农垦大学学报 2021年2期

孟德超，宋玉锡，曹浩，张桐宁，赵畅，白云龙，夏成

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院/黑龙江省牛病防控重点实验室，大庆 163319）

同期排卵-定时输精（简称“同期发情”）技术已成为我国各大牛场繁殖管理中重要内容。奶牛理想产犊间隔为12 个月，但目前大多数牛场很难达到这一标准[1]。奶牛产犊间隔通常在285～581 d。我国目前大部分牛场的产犊间隔平均为400 多天，且有逐年上升的趋势[2]。据调查显示，2013 年我国荷斯坦奶牛平均产犊间隔在415 d 以上，产后受孕天数110.3 d，产后第一次发情配种天数为77.6 d[3]。由于同期发情技术能够有效的缩短奶牛产犊间隔，科学合理制定繁育工作计划减轻工作量，还能治疗部分繁殖疾病。该技术的应用为牛场创造了巨大的经济效益。同期发情技术主要是通过对奶牛使用激素类药物，影响母牛发情周期，根据生产实际的需要，使同一批次的奶牛在规定的时间内发情、排卵并进行输精[4]。同期发情技术是大型牛场繁育的重要环节，也是缩短产犊间隔的重要手段，对提高奶牛繁殖效率具有重要意义[5-6]。

目前，Presynch-Ovsynch（PO）程序作为牧场最广泛使用的同期发情技术之一，实际生产中能有效提高奶牛的发情率和妊娠率。该技术极大地减轻了人工观察发情的工作量，且具有效果可靠、使用面广、可控性强、效率更高等优点[7]。但不同牧场的奶牛对PO 程序的效果反映差异较大。随着预警体系在奶牛生产中的应用，许多能量状态的生物标志物如BHBA、NEFA 已被用于奶牛的健康监测[8]。在个体奶牛水平上建立了BHBA、NEFA 的阈值来表明患病的高风险，筛选出有价值的生物标志物并根据其阈值水平实施适当的干预措施，以减少疾病发生。然而关于奶牛卵巢疾病的预警和评估却知之甚少。因此，研究利用PO 程序处理前奶牛血浆生化指标对奶牛输精21 d 后妊娠阴性的风险预警，为牧场同期发情技术的高效应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验选择56 头产后40 d 高产荷斯坦奶牛，奶牛均来自于黑龙江省某集约化牛场，按照中国泌乳奶牛饲养标准饲喂全混合日粮（TMR），自由饮水。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物分组与给药

产后40 d 奶牛进行PO 程序处理，期间发情奶牛进行输精，输精21 d 后根据B 超妊检结果分为P 组（妊检阳性，N=26）、N 组（妊检阴性，N=30）。PO 程序：在产后40 d 注射PG（氯前列醇钠注射液0.2 mg·支-1，2 支），在产后54 d 注射PG（氯前列醇钠注射液100 μg·支-1，2 支），在产后66 d 注射GnRH（戈那瑞林100 μg·支-1，1 支），在产后73 d 注射PG（氯前列醇钠注射液0.2 mg·支-1，2 支），在产后75 d 注射GnRH（戈那瑞林100 μg·支-1，1 支）。如果PO 程序期间试验奶牛发情即可停药，输精。

1.2.2 试验动物的日粮组成

日粮配比为青贮49.35%、浓缩料18.62%、全棉籽2.02%、玉米10.99%、进口苜蓿5.38%、糖蜜3.36%、玉米蛋白粉2.24%、碳酸钾0.18%、水7.85%。营养水平为钙0.36%、磷0.36%、钠0.36%、镁0.40%、钾0.81%、锌0.028%。

1.2.3 体况及血液的采集与生化检测

根据奶牛体况评分标准（5 分制）利用BCS Cowdition 软件对产后40 d 奶牛进行体况评分，并在清晨对试验奶牛尾根静脉采血20 mL，注入肝素抗凝管。使用低转速离心机以3 000 r·min-1离心10 min，取上层清液，再用高速离心机12 000 r·min-1离心5 min，分装血清，-80 ℃下保存至生化检测。矿物质元素检测项目及方法：钙（Ca）、镁（Mg）使用偶氮胂Ⅲ比色法；磷（P）采用紫外线终点法；硒（Se）使用原子吸收法。肝功指标检测：谷草转氨酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）均采用速率法。能量代谢检测项目及方法：甘油三酯（TG）采用酶法检测；总胆固醇（TC）、β-羟丁酸（BHBA）采用化学法检测；葡萄糖（Glu）以葡萄糖氧化酶法检测、游离脂肪酸（NEFA）通过比色法检测。激素检测项目及方法：雌二醇（E2）、孕酮（P4）采用化学发光法；胰岛素（INS）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）利用ELISA 检测。其他指标：维生素E（VE）、牛结合珠蛋白（HP）、脑源性神经营养因子（BDNF）、活性氧（ROS）、牛组胺（HIS）均以ELISA 检测。

1.3 统计分析

使用IBM SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析，数据以“平均值±标准差”表示。先采用独立样本t检验对两组检测指标进行显著性分析，再使用斯皮尔曼相关系数对存在显著性差异指标进行相关性分析。建立二元Logistic 回归来模拟各项指标对PO 程序奶牛妊检结果的预测性，采用受试者工作曲（ROC）分析风险预警效果及最佳预警值。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 试验奶牛的临床背景资料

由表1 可知，两组的年龄、胎次、体况和上一年泌乳量均无显著性差异（P＞0.05）。

表1 试验奶牛的临床背景资料Table 1 Clinical background data of all experimental cows

2.2 试验奶牛血浆矿物质元素水平

由表2 可知，N 组的血浆Se、Mg 含量极显著的低于P 组（P＜0.01）；N 组的血浆P 含量极显著的高于P 组（P＜0.01）；Ca 含量无显著性差异（P＞0.05）。

表2 试验奶牛血浆矿物质元素水平Table 2 Plasma levels of mineral elements in all experimental cows

2.3 试验奶牛HP、ROS、BDNF、HIS 及VE 水平

由表3 可知，两组试验奶牛HIS 指标存在极显著差异（P＜0.01）；其他指标组间无显著性差异（P＞0.05）。

表3 试验奶牛血浆HP、ROS、BDNF、HIS 及VE 的水平Table 3 Plasma levels of HP，ROS，BDNF，HIS and VE in all experimental cows

2.4 试验奶牛血浆激素水平

由表4 可知，N 组的血浆E2含量极显著的低于P组（P＜0.01）；其他指标组间无显著性差异（P＞0.05）。

表4 试验奶牛血浆激素的水平Table 4 Plasma levels of hormones in all experimental cows

2.5 试验奶牛肝功和能量代谢的状况

由表5 可知，N 组的血浆Glu 含量极显著低于P组（P＜0.01），血浆BHBA、TG 含量极显著高于P 组（P＜0.01），血浆AST 含量显著高于P 组（P＜0.05），其他指标组间无显著性差异（P＞0.05）。

表5 试验奶牛血浆肝功和能量代谢的水平Table 5 Plasma levels of liver function and energy metabolism in all experimental cows

2.6 奶牛PO 程序同期发情效果预警评估

表6 列出了与奶牛妊检阴性相关的指标。血浆BHBA、HIS、AST、TG、P 与21d 妊检阴性呈显著正相关（P＜0.05）；血浆E2、Glu、Se、Mg 与21d 妊检阴性呈显著负相关（P＜0.05）。

表6 PO 程序奶牛血液检测指标与N 组的相关性Table 6 Correlation between presynch ovsynch treatment of dairy cows pregnancy negative and biochemical traits in plasma

使用二元Logistic 回归模型模拟以上指标对PO程序奶牛妊检阴性的预测性。分析得出，血浆E2、Glu和Se 水平可预测PO 程序奶牛的妊检结果。

表7 妊检阴性诊断的E2、Glu、Se 的分界值、敏感度、特异性、标准误及ROC 曲线下面积Table 7 The cutoff point，sensitivity，specificity，standard error，and area under the ROC（receiver operating characteristic）curve of E2，Glu and Se diagnosed by pregnancy negative

表7 和图1 可知，通过Youden 指数确定PO 程序奶牛妊检阴性相关指标的最佳预警值为血浆E2＜46.49 pmol·L-1、敏感度为84.6%、特异度为90%；血浆Glu＜3.59 mmol·L-1、敏感度为69.2%、特异度为100%；血浆Se＜0.58 μg·L-1、敏感度为100%、特异度为70%。E2、Glu 和Se 的ROC 曲线下面积分别为0.808、0.854 和0.854，具有一定的诊断意义。E2、Glu和Se 的联合ROC 曲线下面积为0.938，具有较高的诊断意义。

图1 妊检阴性奶牛血浆E2、Glu 和Se 诊断的曲线下面积Fig.1 Area under the ROC of E2，Glu and Se diagnosed by pregnancy negative

3 讨论

3.1 血浆矿物质元素对试验奶牛妊娠的影响

硒（Se）是机体必须的微量元素。已有研究表明，缺Se 与奶牛受胎率降低，流产、死胎、产后停滞以及胎衣不下有关，使雌性动物的子宫活动力降低，排卵数减少，精子在生殖道内的活力下降[9]。并且低硒奶牛有更低的首配受胎率[10]。这与试验中N 组奶牛血浆Se含量极显著的低于P 组的结果相一致，奶牛血浆中Se含量较低会对PO 程序奶牛的妊娠有不良影响。

奶牛机体中Ca、P 比例是维持相对恒定的，Ca、P比例失衡会影响奶牛繁殖性能，增加奶牛患不孕症的风险。研究发现患有繁殖障碍的奶牛血浆P 含量显著提高，Ca 含量显著降低，Mg 含量显著降低，并且钙磷平衡可以作为奶牛不孕症的预测指标[11-12]。实验中N 组奶牛血浆中P 浓度显著高于P 组，结果与其相符。低血钙奶牛的围产期并发症的发生率更高，导致产犊间隔时间延长，对繁殖性能造成不利的影响[13]。经调查了解到牧场会定期对奶牛进行补Ca 措施，预防疾病发生。由此可见牧场也需注意Mg 的补充，要注意产后奶牛饲料中矿物质元素的合理调节，预防矿物质元素的缺乏或过剩对奶牛妊娠造成影响。

3.2 血浆炎性因子对试验奶牛妊娠的影响

牛组胺（HIS）是重要的炎性标记物，存在于肥大细胞（MC）内。研究表明，MC 与女性胚胎植入、流产、不孕症有关[14]。一项研究报告了免疫-神经-内分泌网络在妊娠中的作用，Yuan 等[15]的研究表明子宫神经与MC 之间存在相互作用。他们报告说，截肢子宫的自主神经后，子宫MC 数显着增加。而且，这种作用导致组胺存储减少和组胺释放增加。过量的组胺水平会增强Th1 反应，同时抑制胚胎植入前的Th2 反应，这导致植入的免疫学失败。翟明胜等[16]发现HIS 能影响子宫，卵巢等器官的生理机能，与生殖系统密切联系。研究中N 组血浆HIS 含量极显著的高于P 组，在输精前奶牛组胺含量较低时更有利于奶牛妊娠。因此，在奶牛生殖系统的周期变化和生殖器官的生理机能等方面，HIS 的作用值得关注。

3.3 血浆激素对试验奶牛妊娠的影响

雌二醇（E2）作为主要的生殖激素对奶牛产后发情进行调控。垂体由于GnRH 刺激分泌FSH，FSH 促使卵泡发育，在LH 的协同作用下产生E2，当E2达到峰值又会刺激GnRH 释放增多，LH 分泌增多直到达到分泌峰值，LH 与FSH 会协同作用，排出成熟卵泡[17]。低水平E2无法对下丘脑-腺垂体-卵巢轴进行正反馈作用，不能刺激GnRH 释放，因此不能诱导排卵。并且孙书函等[18]已有研究表明子宫复旧不全的奶牛血浆中E2含量低。试验中N 组血浆E2含量极显著的低于P 组，所以输精前奶牛E2含量低不利于奶牛的妊娠。

3.4 血浆肝功和能量代谢指标对试验奶牛妊娠的影响

高产奶牛泌乳早期所消耗能量超过其摄入的营养，导致葡萄糖（Glu）不足，使得奶牛脂肪动员以维持能量消耗，易发生能量负平衡（NEB）。NEB 奶牛更易发生代谢病和繁殖障碍，严重影响卵巢功能[19]。β-羟丁酸（BHBA）是肝脏在不完全脂肪酸氧化过程中产生的三种主要酮类之一，奶牛血浆葡萄糖和血清BHBA 可以作为产后排卵和妊娠状态的预测指标[20]。试验中N 组血浆Glu 浓度显著的低于P 组，说明输精前Glu 含量会影响奶牛的妊娠率，与Hill S L 等人实验结果相符。较低浓度的血清BHBA 会使奶牛有更好的繁殖性能，P 组奶牛的血浆BHBA 含量极显著低于N 组，也证实了这一点。由此可见血浆中较低的Glu 含量和较高的BHBA 含量会影响奶牛繁殖性能。

研究发现脂肪肝会降低奶牛优势卵泡的成熟率，造成卵泡生长发育延迟[21]。在奶牛产后7～14 d 期间血浆中甘油三酯（TG）的浓度会增加，这时如果不合理调整体况会导致脂肪肝发生，导致奶牛进入NEB 状态影响繁殖[22]。并且TG、AST 已经可以作为脂肪肝检测指标[23]。在试验中N 组血浆TG 含量极显著的高于P 组，血浆AST 含量显著的高于P 组，并且N组部分奶牛有患脂肪肝的风险。分析认为产后奶牛血浆中TG、AST 含量会对于奶牛的妊娠产生影响。后续还需大量样本进行进一步验证，一旦得到证实和完善，将对提高集约化牛场奶牛繁殖效率具有重要意义。