阿拉善马鹿冬季肠道菌群组成的性别差异

于 威 李俊乐 滕丽微，2 刘振生，2*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2.国家林业和草原局野生动物保护学重点开放实验室，哈尔滨，150040)

动物的胃肠道中寄居着多种菌群，数量庞大，各个菌群之间有复杂且动态的变化，通过对宿主利害的分类，将其分为益生菌、有害菌和条件致病菌[1-2]。在长期的进化过程中，肠道菌群与宿主之间具有互惠互利的关系，宿主可为菌群提供生境、水分、食物等，而菌群及其代谢产物又为宿主的代谢与免疫提供协助作用[3]，肠道菌群的结构及多样性与多种外界因素有关，如食性[4]、年龄[5]、季节[6]、饲养方式[7]及海拔[8]等因素。袁欣等[9]认为肠道菌群间的性别二态性是有性类固醇水平的差异所驱动，其对肠道黏膜完整性及通透性产生不同影响，结合肠道性激素受体及调节β-葡萄糖醛酸酶剂胆汁酸水平产生作用而进一步对肠道菌群的多样性产生影响。肠道微生物对于宿主极其重要，参与着宿主的消化吸收、免疫及新陈代谢等功能，其多样性的降低会对宿主产生不利影响[10]。如罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)SL001对小鼠肠道菌群多样性及结构产生有利影响，从而对小鼠整体产生积极作用[11]；不同脂肪源会对卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)肠道菌群的群落结构、丰富度及多样性产生影响，对卵形鲳鲹肠道微生物菌群具有显著影响[12]；不同年龄段大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)不同性别之间肠道菌群结构存在显著差异，与不同地点的喂食方式有关[13]；高脂饮食对于小鼠不同性别肠道菌群结构影响也是不同的，其与小鼠雌雄之间体内激素水平的不同有直接的关系[14]。总而言之，在同一地区，物种在性别上肠道菌群结构及多样性可能与多种因素有关。

马鹿(Cervuselaphus)是北方森林草原型动物，其栖息生境极为多样，食性很广且不同地区的食性也不同，分布广泛，主要集中于欧亚大陆和北美大陆的山麓西部，中国分布8种，分别为阿拉善亚种(C.e.alashanicus)、塔里木亚种(C.e.yarkandensis)、天山亚种(C.e.songaricus)、阿尔泰亚种(C.e.sibiricus)、东北亚种(C.e.xanthopygus)、甘肃亚种(C.e.kansue-nsis)、四川亚种(C.e.macneilli)和西藏亚种(C.e.wallichii)8个亚种，为国家二级保护动物[15]。国内对马鹿的研究甚广，涉及到生境[16-17]、食性[18]、家域及性别比[19-20]和分子生态及营养[21]等，对于马鹿肠道菌群结构少有研究。本研究通过高通量测序技术对阿拉善马鹿雌雄冬季肠道菌群结构的研究，分析了其雌雄间冬季肠道菌群的结构及差异，并为后续研究马鹿肠道菌群的雌雄二态性提供了借鉴。

1 研究地概况

贺兰山脉位于宁夏回族自治区与内蒙古自治区交界处，北起巴彦敖包，南至毛土坑敖包及青铜峡(105°49′—106°42′E，38°21′—39°22′N)。贺兰山南北长220 km，东西宽20—40 km，山体西侧地势和缓，没入阿拉善高原。贺兰山地区是季风气候和非季风气候的分界线，垂直气候带较为明显，具有气候干燥，夏季炎热，冬季严寒，雨雪稀少，风大沙多，蒸发强烈的特点。此地区动植物资源丰富，植物有云杉(Piceaasperata)、山杨(Populusdavidiana)、白桦(Betulaplatyphylla)等665种；动物有马鹿、盘羊(Ovisammon)、石貂(Martesfoina)、蓝马鸡(Crossoptilonauritum)等180余种。

2 材料与方法

2.1 样品采集

2017年2—4月初在贺兰山地区采集野生阿拉善马鹿群体的粪便样本78份。为防止采集粪便时交叉感染，每采集1个样本，换1副PE手套。并将样本放入95%的无水乙醇中保存，带回实验室后放入冰箱保存。

2.2 个体与性别鉴定

本实验使用QIAGEN QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒提取DNA。将提好的DNA留取1份放置于-80℃冰箱冻存。对样本DNA进行扩增，先用高度多态的微卫星引物，进行个体识别，排出3对重复个体。然后用SRY基因扩增，产生扩增产物的为雄性，无扩增产物的为雌性。

最终选取20份DNA质量较高的粪便样品，进行后续分析。并根据实验结果将样品分为雄性(WIM)组，分别为WA1、WA2、WA3、WA4、WA5、WN1、WN2、WN3、WN4、WN5；雌性(WIF)组，分别为 WA6、WA7、WA8、WA9、WA10、WN6、WN7、WN8、WN9、WN10。

2.3 高通量测序

在Miseq 2×300 bp平台上，利用高通量测序技术，对20份阿拉善马鹿样品进行16S rRNA的V3-V4区进行扩增，将具有高度相似性(97%)的有效序列进行OUT划分，绘制韦恩图。与数据库对比，同时进行物种分类分析，得到样品所含菌群。Alpha 多样性：通过Ace、Chao1、Shannon和Simpson 4个指标来衡量菌群丰富度，通过稀释曲线来验证实验样品数量的合理性。Ace和Chao1值越大，说明群落的丰富度越高，Shannon值越大菌群的丰富度越高，Simpson值越大，菌群的丰富度越低。NMDS分析法，适用于样本中无法获得精确度的数据，是将多维空间的样品降低到低维空间进行分析。在多维空间上通过点的形式，表示样品之间的差异度。UniFrac的heatmap图，可直接通过颜色来表示样品间的相似度，颜色越蓝表示样品间的相似性越低，颜色越红表示样品间的相似性越高。LEfSe分析法，通过线性判别得到样品中具有重要作用的菌群。

3 结果与分析

3.1 样品中有效序列和OTU数目

此次研究通过高通量测序技术对20份样品便进行16S rRNA测序。共获得有效序列1 564 112条，平均每个样品中含有78 205条有效序列，其中雌性834 113，雄性含有72 999。基于相似度>97%的原则，将获得的有效tags序列进行聚类，共获得7 817个OTUs，平均每个样品含有390个OTUs。其中，有效序列数量最高的是WA4有109 045条有效序列，最低的是WN7有47 184条有效序列，二者相差61 861条。韦恩图中重叠部分为所有样品共有的OUT数目，由图1可知20个样品中共有4 254个OTUs。

3.2 Alpha多样性分析

本研究通过对20份样品的Alpha多样性分析指数进行丰富度和多样性比较。从图2可以看出，随着测试深度的不断加深，稀释曲线从不断上升，直至趋于平缓，说明样品的测序深度比较合理。

Alpha多样性分析指数分析结果说明(表1)，样品菌群的丰富度和多样性都相对较高。20份样品中菌群丰富度指数中雌性相对较高为WA1(Ace 3 028.42，Chao1 2 580.29)，较低为WA3(Ace 2 106.89，Chao1 2 011.40)；雄性相对较高为WN9(Ace 2 901.85，Chao1 2 899.49)，相对较低为WN6(Ace 1 973.08，Chao1 1 744.33)。样品中雌性和雄性Shannon指数相对较高分别为WN3(5.75)和WN8(5.85)，相对较低的分别为WA5(4.27)和WN6(4.63)。样品雌性和雄性中Simpson指数相对较高的分别为WA5(0.06)和WA10(0.04)，相对较低的分别为WN3(0.01)和WN8(0.01)。样品的覆盖度都在99.17%以上，说明测序结果足以充分地反映了样品的真实情况。

表1 雌性和雄性马鹿肠道微生物多样性指数

3.3 物种注释

在门水平和属水平上对样品进行物种注释，20个样品共获得25个菌门，278个菌属。在门水平上，雌性和雄性含量最高的5个菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)。其中，雌和雄各菌门的含量分别为：厚壁菌门(54.47%±17.25%，49.47%±15.21%)，拟杆菌门(8.38%±4.21%，10.31%±7.19%)；变形菌门(54.41%±13.99%，5.89%±3.42%)；疣微菌门(12.98%±2.24%，14.21%±1.50)；放线菌门含量分别为(17.48%±2.91%，4.77%±0.43%)(图3)。

在属水平上，雌性和雄性含量最高的5个菌属为孢杆菌属(Sporobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属系列(ClostridiumIV、ClostridiumXIV)、罗氏菌属(Roseburia)。其中，雌和雄各菌属的含量分别为：孢杆菌属含量为(6.79%±3.99%，7.97%±3.71%)，拟杆菌属(3.87%±2.25%，4.42%±1.13%)，梭菌属系列(3.61%±1.42%，3.70%±1.21%)，ClostridiumXIVa(3.49%±2.39%，3.74%±0.68%)，罗氏菌属(2.65%±1.88%，3.35%±1.79%)。

3.4 NMDS分析和基于UniFrac的heatmap图

从UniFrac的heatmap图中雄性组的组间相似性相对较低，雌性组的组间相似性相对较高。从NMDS图中可以看出雌性和雄性阿拉善马鹿肠道菌群的门水平和属水平两组菌群组成均有明显的分离现象(图5，图6)。

3.5 LEfSe(Linear Discriminant Analysis Effect Size)分析法

通过检测性别因素对阿拉善马鹿肠道菌群影响的差异程度(P=0.03)，说明性别因素具有显著性差异。再利用线性判别可以得到，冬季组起到重要作用的菌群包括甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)和诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)(图7)。

4 讨论

高通量测序技术在微生物的分离及扩增上有着良好的应用[22]，尤其在肠道菌群多样性及结构上的研究有广泛应用。已有研究表明，海南特种野猪(Susscrofa)的肠道菌群存在着性别差异，且雄性肠道菌群较雌性更为丰富[23]；高脂肪饮食对小鼠肠道菌群的影响也具有性别差异[14]；性别对人类婴儿肠道菌群在科水平上构成具有影响[24]；这可能由性别对动物造成的激素水平差异所导致[9]。这说明性别因素可能会造成动物雌雄肠道菌群的差异。

本文通过16S rRNA高通量测序技术对阿拉善马鹿雌雄冬季肠道菌群的结构进行了分析。结果表明，阿拉善马鹿雌雄肠道菌群的丰富度及多样性都很丰富且存在差异，其中雌性较雄性肠道菌群多样性更为丰富。在门水平上，雄性的肠道优势菌群为厚壁菌门和疣微菌门，而雌性的肠道优势菌群为厚壁菌门和变形菌门，无论是雌性还是雄性，厚壁菌门都是马鹿肠道菌群中最丰富的菌种，在肠道中主要功能是分解纤维素，以供宿主使用，其与变形菌门的数量比例可能是造成肥胖的原因，对纤维素的食用也是造成厚壁菌门积累的原因[25]。说明对于阿拉善马鹿，无论是雌性还是雄性，冬季对于高纤维食物的食用都是较高的，而高纤维食物都是易于获取的。雌性较雄性马鹿而言，变形菌门的丰富度较高，据以往研究所知，变形菌门是大熊猫的肠道优势菌群，在对木质素的消化中起着重要的作用，对于肠道健康也有着至关重要的作用[26-28]，这可能与阿拉善马鹿雌雄体型造成的食性差异所致，雌性较雄性的体型要更矮小，对于灌木根部的啃食相对频繁，导致雌性马鹿对木质素的摄取较多，使雌性马鹿变形菌门的丰富度较高。在属水平上，雌雄马鹿肠道优势菌属都为芽孢杆菌和拟杆菌属，但在丰度上存在差异。肠道菌群构成的性别差异广泛存在于各个物种中[29]，我们结合NMDS分析法可以得出雌雄马鹿的肠道菌群在门属水平上都存在分离，其雌雄肠道菌群组成上存在差异，说明马鹿肠道菌群组成受性别影响。通过LEfSe分析法我们得到性别因素对阿拉善马鹿肠道菌群的影响存在显著差异(P<0.05)，得到甲基杆菌科和诺卡氏菌科在冬季肠道菌群中起到主要作用，甲基杆菌科广泛存在自然环境中，既能独立存在于土壤和水中，也分布于植物的叶、茎及根中，其能促进植物根瘤及叶的生长[30]，在冬季寒冷缺乏食物的环境下，雌雄马鹿可采食灌木的干叶和根茎，因而成为冬季的肠道菌群的主要构成。诺卡氏菌科广泛存在于水生环境及土壤中[31]，这是由于植物雪下根部潮湿，有诺卡氏菌的分布，而造成其在马鹿冬季肠道菌群的主要构成。

本研究为阿拉善马鹿雌雄肠道菌群未来的深入研究提供了基础，并建议未来对阿拉善马鹿肠道菌群的性别差异应更密切关注菌群组成与功能的关系及性激素的影响，这将对性别因素对阿拉善马鹿肠道菌群的影响原因有更深入的认识。