竹类植物分蘖相关基因的生物信息学分析

孙佳玮郭振华

（1.中国科学院昆明植物研究所，中国西南野生生物种质资源库，云南 昆明 650201；2.中国科学院大学，北京 100049）

竹亚科（Bambusoideae）属于禾本科（Poaceae）的12个亚科之一，共125属1 670种，可分为草本竹与木本竹两大类[1]。竹类的地下茎俗称竹鞭，形态特征较稳定，不仅是竹亚科分类的重要依据之一，而且对竹类的生长发育起着关键的营养运输的作用。根据竹类地下茎营养器官繁殖特点和形态特征可划分为粗型和细型。粗型地下茎即合轴型，在地下没有竹鞭，母竹侧芽直接发育成竹，地上部表现为密集丛生；细型地下茎即单轴型，母竹侧芽发育成竹鞭，且鞭上侧芽可以再发育成笋或鞭，在地上表现为散生状[2]，形成庞大的地下茎网络。粗型地下茎的竹类生长模式与禾本科其他类群的分蘖生长有相似之处，而细型地下茎的竹类则不产生或少量分蘖，形成独特的地下茎系统。因此，探究竹子不同类型的地下茎的形成与禾草植物的分蘖之间的关系将有助于对竹类地下茎发育模式的理解。

前人分别在雷竹（Phyllostachys praecox）、美丽箬竹（Indocalamus decorus）等单一竹种中的研究表明，ABA、GA3、ZT、IAA等激素参与了竹类地下茎侧芽的萌发过程[3-4]，但相关基因的研究尚未见报道。在模式植物水稻中的分蘖相关基因已有了较系统的研究，且有研究表明，某些分蘖相关基因参与到这些激素的信号通路中，最具代表性的就是MOC1基因，其编码的蛋白产物包含VHIID和SH2−like结构域，属于植物特有的GRAS家族蛋白，参与了植物侧枝形成、根辐射方向结构分布、光信号传导、植物激素赤霉素的信号传导和植株高度控制等多种重要的生理和发育过程[5]。因此本研究从水稻（Oryza sativa）中选取相关的候选基因，对毛竹（Phyllostachys heterocycla）和4种新测序的竹类植物[6]以及水稻、谷子（Setaria italica）和二穗短柄草（Brachypodium distachyum）的分蘖数相关基因和氨基酸序列进行比较研究，发现其中差异从而为后续不同地下茎类型的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料介绍

现已有5种竹子的基因组完成测序，分别代表了竹类的2种地下茎类型（图1）和所有的倍性：地下茎为细型的四倍体毛竹；地下茎为粗型的四倍体瓜多竹（Guadua angustifolia）和六倍体芸香竹（Bonia amplexicaulis），以及二倍体草本竹Olyra latifolia和Raddia guianensis。同时选取了模式植物水稻，以及禾本科的二穗短柄草和谷子为参考。

图 1 木本竹地下茎类型[7]Fig.1 Rhizome types of woody bamboo

1.2 竹类分蘖基因的鉴定及序列分析

在funRiceGenes网站（https://funricegenes.github.io/）找到了51个与水稻分蘖数相关的基因，通过NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以 及Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/）对这51个基因进行再次确认。将以上基因作为候选基因，在NCBI网站使用BLAST工具，用blastp与blastn方法，在5种竹子的基因组中获取这些基因的同源序列，将获得的同源序列进行建树、筛选，从而更准确获取同源序列，用DNAMAN软件对其DNA和氨基酸序列进行比对。

1.3 进化树构建与同源序列分析

使用MEGA X软件对水稻、二穗短柄草、谷子、毛竹、瓜多竹、芸香竹、草本竹Olyra latifolia和Raddia guianensis的各基因比对结果进行分析，运用最大似然法（ML），设置1 000次检验构建进化树。候选基因的氨基酸序列的分子量、等电点、序列长度、脂溶性系数等信息通过网站（http://www.expasy.org）获取。在MEME（http://meme-suite.org/index.html）网站对候选基因进行motif预测，并通过TBtools软件作基因结构图。

2 结果与分析

2.1 基因比对结果

从获得的51个与水稻分蘖数相关的基因，通过序列比对分析发现其中17个基因在竹类与水稻、二穗短柄草及谷子存在明显差异，包括：D10、DLT、Gn1a、HTD1、LAX1、MOC1、Os-AAP3、OsCYP19−4、OsEATB、OsIAGLU、OsPIN1、OsPIN5b、OsSPL14、OsSUT2、OsTB1、RFL、THIS1。基因序列以Osa代表水稻，Bdi代表二穗短柄草，Sit代表谷子，Ped代表毛竹，Bam代表芸香竹，Gan代表瓜多竹，Ola代表Olyra latifolia，Rgu代表Raddia guianensis。（正文中只列出D10、OsCYP19−4、OsEATB、DLT、Gn1a、LAX1、MOC1、OsPIN5b、OsSPL14、OsTB1等部分基因，其余请见电子附图1～7。）

2.2 基因功能分类

2.2.1 使分蘖数增加的基因

竹子D10基因的氨基酸序列信息如表1，D10基因的氨基酸序列比对结果如图2所示，相似度为77.22%。D10基因的进化树（图3）及motif信息（表2）如下。motif 1、2、3、4、5、9、10对应类胡萝卜素裂解双加氧酶的编码区。草本竹Olyra latifolia和芸香竹的序列较为保守；RguD10b序 列 缺 失motif 4、5、6、7，毛竹PedD10a序列缺失motif 4、5，PedD10b序列缺失motif 4、6、7，这3条序列较其他序列在motif 2前多1个motif 8；瓜多竹的两条序 列缺少motif 3。D10基因编码类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD8），参与独角金内酯（SL）的生物合成以及侧根、侧芽的萌发，在根中柱、叶芽、茎、花序和圆锥花序的木质部薄壁细胞中表达[8]，植株表现为矮化，分枝和分蘖数增加。D10蛋白定位于叶绿体。Raddia guianensis和毛竹序列中所缺失的片段为CCD8的功能域。

表 1 竹子D10基因的氨基酸序列信息Table 1 Amino acid sequence information of bambooD10gene

图 2D10基因的氨基酸序列比对结果Fig.2 Amino acid sequence alignment results ofD10gene

图 3D10基因的进化树及结构域Fig.3 Evolutionary tree and motif ofD10gene

表 2D10基因的motif信息Table 2 Motif information ofD10gene

OsCYP19−4基因的氨基酸序列比对结果显示相似度为21.55%。竹子的氨基酸序列信息如表3。OsCYP19−4基因进化树及motif如下（图4）。motif 2、3、5对应的结构域为Pro-isomerase。除水稻和Raddia guianensis外，其他序列中都存在motif5，草本竹Olyra latifolia、Raddia guianensis、瓜多竹、芸香竹以及毛竹PedCYP19−4c序列缺失motif 7。OsCYP19−4编码一种包含208个氨基酸的蛋白，编辑的肽脯氨酰顺反异构酶加速蛋白质折叠，催化脯氨酸酰亚胺肽键在寡肽中的顺反式异构化，基因过表达使分蘖增加[9]，此结构域在竹类中较为保守。

表 3 竹子OsCYP19−4氨基酸序列信息Table 3 BambooOsCYP19−4amino acid sequence information

图 4OsCYP19−4基因的进化树、motif及基因结构Fig.4 Evolutionary tree,motif and gene structure ofOsCYP19−4gene

OsEATB基因的氨基酸序列的比对结果显示相似度为63.20%。竹子的氨基酸序列信息如表4。OsEATB基因的进化树及motif如下（图5）。motif 1对 应AP2结 构 域。motif 1、3、4、5在8个物种中保守。竹类中都包含motif 7，其余3种中不存在。毛竹和芸香竹中有motif 6，Olyra latifolia的motif 1和5之 间 有motif 10插 入，缺失motif 9。OsEATB基因降低成熟时的株高[10]，促进分蘖和小穗分枝发生。

表 4 竹子OsEATB氨基酸序列信息Table 4 BambooOsEATBamino acid sequence information

图 5OsEATB基因的进化树、motif及基因结构Fig.5 Evolutionary tree,motif and gene structure ofOsEATBgene

OsPIN1基因的进化树及motif见电子附图1。除毛竹外，其他4种竹类的序列与水稻、二穗短柄草、谷子的差异极小，毛竹的PedOsPIN1a序列缺失motif 3、4、7、9，PedOsPIN1b序列只有motif 3、4、8。OsPIN1基因在维管组织和根原基中表达，参与分蘖的产生，低表达时会使分蘖数增加[11]。

OsSUT2基因的进化树及motif见电子附图2。此基因在水稻和竹类中相似性较高，motif 1、3、4在8个物种中均保守，motif 5、7在除瓜多竹和草本竹Raddia guianensis外的几个物种中保守。Raddia guianensis、瓜多竹和毛竹中均无motif 2和6。OsSUT2基因编码的蛋白质参与蔗糖代谢的途径，并且减少分蘖的产生[12]。

RFL基因的进化树及motif见电子附图3。芸香竹BamRFLb序列缺失motif 4，瓜多竹序列缺失motif 1和6，在末端多一段motif 9；草本竹Raddia guianensis缺失motif 6、7、8、10，毛竹序列中缺失motif 8、10。RFL基因与开花相关，除调控水稻抽穗期、穗部枝梗发育外，它还可以通过调节一些激素信号分子和转录因子等影响分蘖的形成[13]使分蘖数减少。毛竹缺失的部分为转录因子区域，包含甘氨酸多聚体。

图 6DLT基因的氨基酸序列比对结果Fig.6 Amino acid sequence alignment results ofDLTgene

2.3 使分蘖数减少的基因

DLT基因的氨基酸序列比对结果如图6所示，相似度为83.68%。竹子的氨基酸序列信息如表5。DLT基因的进化树及motif如下（图7，表6）。motif 1、2、4、6、7、8、9对应GRAS结构域。此基因在8个物种中均较为保守，只有毛竹序列缺少motif 4。DLT基因编码一个由617个氨基酸组成植物特有的GRAS家族蛋白，包含leucine heptad Ⅰ、VHIID、leucine heptad Ⅱ、PFYRE和SAW等结构域，是少分蘖矮秆基因[14]。毛竹序列中缺失的片段为PFYRE基序。

表 5 竹子DLT氨基酸序列信息Table 5 BambooDLTamino acid sequence information

图 7DLT基因的进化树、motif及基因结构Fig.7 Evolutionary tree,motif and gene structure ofDLTgene

表 6DLT基因的motif信息Table 6 Motif information ofDLTgene

MOC1基因的氨基酸序列比对结果显示相似度为48.88%。竹子的氨基酸序列信息如表7。MOC1基因的进化树及motif如下（图8）。motif 1、2、3、4对应的结构域为GRAS，motif 5对应一段信号肽。该基因在竹子与水稻中有较高的相

似性，但Raddia guianensis的motif缺失很多。毛竹序列中缺少motif 4和5。MOC1定位于水稻第6号染色体的长臂，编码GRAS蛋白，为单分蘖基因，不产生分蘖，只有一个主茎[5]。

表 7 竹子MOC1氨基酸序列信息Table 7 BambooMOC1amino acid sequence information

图 8MOC1基因的进化树、motif及基因结构图Fig.8 Evolutionary tree,motif and gene structure ofMOC1gene

LAX1基因的氨基酸序列比对结果显示相似度为36.85%。竹子的氨基酸序列信息如表8，LAX1基因的进化树及motif见电子附图4。motif 6对应HLH（helix-loop-helix）结 构；motif 2、3在8种植物中都保守，水稻、谷子、二穗短柄草中无motif7而竹类中均存在。芸香竹BamLAX1b序列缺失motif 4、6，Raddia guianensis序列缺失motif 1、4、6，缺失HLH结构。LAX1基因编码植物特有的bHLH转录因子，对基因的转录发挥调控作用，可以控制水稻的腋芽原基形成，减少分枝分蘖的产生[15]。

表 8 竹子LAX1氨基酸序列信息Table 8 BambooLAX1amino acid sequence information

Gn1a基因的氨基酸序列比对结果显示相似度为67.42%。竹子的氨基酸序列信息如表9。Gn1a基因的进化树及motif见电子附图5。motif 2、6、9对应FAD结合区，motif 1、3、4、5、7、8为Cytokin（细胞因子）结合区。motif 1、3、4在8个物种中保守。瓜多竹GanGn1a−1序列缺失motif 8，GanGn1a−2序 列 缺 失motif 5、6、9、10，Raddia guianensis序 列 缺 失motif 6、8、9，毛 竹PedGn1a−1序 列 缺 失motif 2、6、9、10，PedGn1a−2序列缺失motif 6、9、10。Gn1a基因在叶、茎及花和花序分生组织中表达，另外可调控减少分蘖产生，基因沉默会使分蘖增加[16]。

表 9 竹子Gn1a氨基酸序列信息Table 9 BambooGn1aamino acid sequence information

OsPIN5b基因的氨基酸序列比对结果显示相似度为51.89%。竹子的氨基酸序列信息如表10。OsPIN5b基因的进化树及motif见电子附图6。motif 3、6对应一个Mem_trans结构域。motif 1、2、3、4在所有序列中保守。毛竹序列和BamPIN5b−1序列缺失motif 2、5、6。OsPIN5b基因过表达会使分蘖减少，降低表达量使分蘖增加，可能作为生长素外排载体的组成部分，在根和茎顶端表达[17]。

表 10 竹子OsPIN5b氨基酸序列信息Table 10 BambooOsPIN5bamino acid sequence information

OsSPL14基因的氨基酸序列比对结果显示相似度为63.82%。竹子的氨基酸序列信息如表11。OsSPL14基因的进化树及motif见电子附图7。motif 1对应的结构域为SBP，含有1个锌指结构。motif 2、4、5、6、7、8在所有序列中保守，草本竹Raddia guianensis和毛竹与其他物种的序列差异较大，缺失motif 1、3、9，无SBP结构域。OsSPL14基因可能与穗的发育有关，使分蘖数减少[18]。起始84个氨基酸序列为富含甘氨酸区域，毛竹缺失的为此结构域。所有序列中都保守的区域为双组分核定位信号区。

表 11 竹子OsSPL14氨基酸序列信息Table 11 BambooOsSPL14amino acid sequence information

OsTB1基因的氨基酸序列比对结果显示相似度为65.71%。竹子的氨基酸序列信息如表12。OsTB1基因的进化树及motif见电子附图8。motif 1、8对应的是TCP结构域。谷子和竹类的基因序列中包含motif 3而水稻和二穗短柄草序列中不存在。毛竹的两条序列中均缺失motif 2，Raddia guianensis中还有motif 1、5、6缺失。OsTB1调节侧芽的生长，编码一个由388个氨基酸组成的蛋白，包括TCP和R结构域[19]。与其他7种植物相比毛竹的同源序列中缺少的为R结构域。

表 12 竹子OsTB1氨基酸序列信息Table 12 BambooOsTB1amino acid sequence information

HTD1基因的进化树及motif见电子附图9。瓜多竹序列中只有motif 7、10，Raddia guianensis序列缺失motif5、9，毛竹PedHTD1a序列缺失motif 9，PedHTD1b序 列 缺失motif 5、8、9。其余序列较为保守。HTD1基因是多分蘖矮秆基因，编码胡萝卜素裂解双加氧酶CCD7，通过从休眠期释放腋芽而不是启动更多的腋芽来增加分蘖数[20]。

OsAAP3基因的进化树及motif见电子附图10。此基因在8种植物中较为保守，差异在毛竹两条序列中缺失motif 5，芸香竹序列中也缺失motif 5。OsAAP3基因调控有效分蘖数的增加[21]。

OsIAGLU基因的进化树及motif见电子附图11。motif 1、2、3、5、9、10在8个物种中均保守，瓜多竹缺失motif 4、6、7，Raddia guianensis缺失motif 6、7、8，芸香竹缺失motif 4。OsIAGLU基因过表达，分蘖数和叶片角明显增加，株高和穗长同时降低[22]。

THIS1基因的进化树及motif见电子附图12。motif 1、2、3、6在8个物种中均保守，瓜多竹、毛竹、草本竹Raddia guianensis中缺失motif 4、8，而这3种竹中都存在motif 7。此基因编码一个第Ⅲ类的脂肪酶，调控株高变矮、小穗不育以及多分蘖产生[23]。

3 结论与讨论

以上基因中，MOC1是单分蘖基因，DLT、Gn1a、LAX1、OsTB1、OsPIN5b、OsSPL14、Os-SUT2、OsTB1、RFL基因抑制分蘖产生，D10、HTD1、OsAAP3、OsCYP19−4、OsEATB、OsIAGLU、THIS1基因调控分蘖数目增加。从以上的基因进化树可以看到，无论是使分蘖增加还是减少的基因中，2种草本竹基本都与水稻、谷子、二穗短柄草聚在一起，与3种木本竹类区分开。将草本竹Olyra latifolia和Raddia guianensis地下茎类型也作为粗型（即合轴型），竹类植物中地下茎类型为粗型的竹种与细型的竹种（即毛竹）在DLT、Gn1a、MOC1、OsPIN1、OsPIN5b、OsSPL14、OsSUT2、D10、OsAAP3基因中结构差异很大。调控分蘖增加的基因有结构域的缺失，可能导致不分蘖；而抑制分蘖生长的基因有结构域的缺失，其突变体分蘖减少，这两种情况都有可能抑制毛竹的合轴生长，从而使其进行地下茎的延伸，形成真鞭，分析结果提示，粗型地下茎与细型地下茎的形成可能与调控分蘖数目的基因相关。

竹类地下茎的生长与内源激素也有着密切关系[24]，分蘖数的变化（增加或减少）与各个激素的相互作用也存在联系，如独脚金内酯、生长素等植物激素的信号通路。PIN、AUX/LAX家族类蛋白参与调控植物生长素运输，AUX/LAX调控生长素输入，PIN调控生长素输出[24-25]，参与这些通路的基因包含上述的OsPIN1、OsPIN5b、LAX1；另外，游离IAA水平的降低可能促进水稻分蘖形成[21]。可见植物激素的相互作用对分蘖的产生起着重要的作用，由此推测，除分蘖基因外，竹类不同地下茎类型的形成与这些植物激素也有关联之处。以上这些假设尚需后续研究来证实。