西南远志中酮类化合物的生物活性研究

谭大聪 肖坤敏 孔德仙 马佳钰 郭 磊 王军民 华 燕

（西南林业大学林学院，云南森林资源培育与利用协同创新中心，云南 昆明 650233）

西南远志（Polygala crotalarioides），远志科（Polygalaceae）远志属（Polygala）多年生草本植物，主要分布于我国云南、四川、西藏等地区[1]。西南远志以根入药，用于活血止痛、补心安神、心悸、失眠多梦、虚痨气弱等[2]。西南远志在云南佤族民间用药中被称作“娘母良”，主要用于治疗食欲不振、心悸以及增强体质、强健筋骨等[3]，现代药理学研究也表明，西南远志具有抗疲劳、抗低温、抗缺氧、提高机体应激能力，提高机体对不良环境的适应能力的功效[4]。黄嘌呤氧化酶是人体内产生尿酸过程中的关键酶，同时也是治疗痛风时药物的作用靶点，徐华松等[5]，Hua等[6]，芦毅等[7]从西南远志分离得到了1,2,3,7−四甲氧基酮等化合物，Zhu等[8]的研究表明，1,3,6,7−四羟基酮和格里菲帕维酮2个化合物对黄嘌呤氧化酶抑制活性的半抑制浓度（IC50）分 别 为1.2 μmol/L和6.3 μmol/L，和 别 嘌 呤 醇（IC50=5.3 μmol/L）的活性相当，表明西南远志中的酮类化合物对黄嘌呤氧化酶具有较强抑制活性的能力，对治疗痛风具有较好的疗效。目前临床上治疗痛风的药物只有别嘌呤醇[9]和非布司他[10]。但它们有各自不同的副作用，如别嘌呤醇会引起皮疹、过敏反应和肾病等[11]；非布司他最常见的副作用为肝功能异常、恶心、皮疹、关节痛等[12-13]。中药治疗痛风已有几千年的历史，从中药中寻找高效低毒的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有很大优势及良好前景[14]。西南远志为偶见种，已经濒临灭绝，目前对其酮类化合物的相关研究鲜有研究。本研究通过紫外分光光度法原理测试西南远志中总酮的体外黄嘌呤氧化酶抑制活性和抗氧化活性，采用96孔板法测定其对金黄色葡萄球菌等5种细菌的抑制活性，利用生长速率法测定其对采绒革盖菌等5种真菌的抑制活性，以期阐明酮类化合物抑制黄嘌呤氧化酶活性、抗氧化和抑菌活性的物质基础，为抗痛风药物研制和西南远志的综合利用开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂和材料

Evolution 300紫外分光光度计（Thermo Fisher，美国）；DHG−9030A型不锈钢高温干燥箱（河南马弗炉技术开发有限公司，中国）；Heidolph Digital旋 转 蒸 发 仪（Heidolph Group，德 国）；BK−300GDE超声波清洗器（陕西凯德力环保科技有限公司，中国）；恒温培养箱（郑州安晟科学仪器有限公司，中国）；LDZX−50KBS立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂，中国）；食品级AB−8大孔吸附树脂、无水乙醇（上海源叶生物科技有限公司，中国）等；西南远志采自云南省云县，由西南林业大学林学院杜凡教授鉴定为远志科植物西南远志，标本保存在西南林业大学林学院植物资源利用系药用植物教研室。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备

称取干燥后的西南远志粉末10.0 g，在60 ℃条件下，用65%乙醇，按料液比1g∶30mL，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩得浸膏。以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法[15]测定浸膏中的总酮含量，浸膏中总酮的含量为4.45%。将浸膏用水溶解置于AB−8型大孔吸附树脂上，用蒸馏水洗脱完全；再用30%乙醇去除皂苷类化合物；最后用90%乙醇洗脱，收集洗脱液并减压浓缩得浸膏，即为纯化后的酮类化合物。纯化后酮类化合物的含量为30.22%（其余成分主要为皂苷和糖脂等化合物），纯化后酮类化合物的含量提高了6.79倍。总酮含

量为其质量与浸膏质量之比。

1.2.2 黄嘌呤氧化酶抑制活性测定

参考Masuda等[16]、李英等[17]测定方法，精密称取1.083 8 g KH2PO4，7.315 5 g K2HPO4，加入超纯水定容至250 mL，即得pH=7.5的磷酸缓冲溶液（PBS）；精密称取18.25 mg的黄嘌呤，加入25 mL 0.05 mol/L的NaOH溶液，充分溶解后，然后加入PBS溶液定容至250 mL；取一定量的黄嘌呤氧化酶溶液，用PBS溶液配制得0.08 U/mL的黄嘌呤氧化酶工作溶液；精密称取适量样品，然后加PBS溶液配制成1.5、1.25、1、0.75、0.5、0.25 mg/mL等不同浓度，低温避光保存，待用。将样品及空白溶液（空白为PBS）4 mL，酶溶液2 mL（终浓度0.02 U/mL）于试管中，在37 ℃的水浴锅上孵育3 min，再加入2 mL底物（终浓度0.12 mmol/L）启动反应，在紫外分光光度计动力学模式下291 nm波长处每隔30 s读数1次，共计5 min，每组平行测定3次。取3次的平均值，按公式（1）计算抑制率，经非线性回归方法计算得乙醇粗提物和纯化后总酮对黄嘌呤氧化酶的IC50。

式中：(dA/dt)空白为空白组的反应速率，(dA/dt)样品为样品组的反应速率，dA/dt的时间段选择在30～270 s。

1.2.3 抗氧化活性测定

DPPH自由基清除能力的测定参照孙惠芳等[18]、Kaur 等[19]的方法；ABTS自由基清除能力的测定参照韩锐等[20]、Sun等[21]的方法测定；超氧阴离子自由基（O2·−）清除能力的测定参照谭晓虹等[22]的方法；羟自由基（·OH−）清除能力的测定参照韦玉兰等[23]的方法。

1.2.4 细菌抑制活性的测定

采用96孔板法测定其最低抑菌浓度（MIC）[24]。在96孔板中，第1～10孔加供试样品，第11孔加空白对照，第12孔加阳性对照，在1～12孔中都加入100 μL液体培养基，实验组利用二倍稀释法加入50 μL浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1 mg/mL的样品，第1～10孔的最终浓度分别为5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1、0.019 5、0.009 8 mg/mL，每个浓度均设3个复孔做平行对照，空白对照加入50 μL无菌水，阳性对照组加入0.1 g /L的链霉素溶液50 μL。每孔中加入50 μL菌液，在37 ℃恒温培养箱中培养1 d，加入0.2 g /L的碘硝基四唑紫40 μL，以是否出现紫色来检查有无细菌生长，以不出现紫色的微孔浓度为最低抑菌浓度[25-26]，所有操作均在无菌条件下操作。

1.2.5 真菌抑制活性的测定

生长速率法[27]：采用二倍稀释法配制成浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg /mL的样品溶液，121 ℃灭菌22 min后转移至超净工作台中分装至无菌培养皿（9 cm直径）中。溶剂对照采用不加样品的无菌水，空白对照为不加任何样品和溶液的PDA培养基。用灭菌后的5 mm打孔器在已活化好的病原真菌菌落上打取菌饼，在每个培养皿中心位置放1个菌饼，然后标记后放入培养箱培养10 d，观测记录，所有病原真菌应在同一天内接种完毕。按公式（2）[28]计算抑菌率（IR），经非线性回归方法计算得各菌的半抑制浓度（EC50）。

式中：D0为空白对照净直径，Ds为处理组净直径，Dn为溶剂对照净直径。

2 结果与分析

2.1 西南远志乙醇粗提物和纯化后总酮对黄嘌呤氧化酶的抑制活性

图 1 西南远志乙醇粗提物和纯化后总酮对黄嘌呤氧化酶的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of the crude ethanol extract and the xanthone compounds after purification from P. crotalarioidesagainst xanthine oxidase

2.2 西南远志乙醇粗提物和纯化后总酮对4种自由基的抑制活性

7.33 μg/mL。

图 2 西南远志乙醇粗提物和纯化后总酮对4种自由基的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of the crude ethanol extract and the xanthone compounds after purification fromP. crotalarioidesagainst 4 radicals

2.3 西南远志纯化后的总酮对5种细菌的抑制活性

5 mg/mL。

表 1 纯化后酮类化合物对不同食源性致病菌的MICTable 1 The MIC of purified xanthone compounds against different food-borne pathogens mg/mL

表 1 纯化后酮类化合物对不同食源性致病菌的MICTable 1 The MIC of purified xanthone compounds against different food-borne pathogens mg/mL

注：“-”表示无菌生长；“+”表示菌生长较弱；“++”表示菌生长较强；“+++”表示菌生长强。

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2.4 西南远志纯化后的总酮对5种真菌的抑制活性

由表2可知，在5种真菌中，对采绒革盖菌（Coriolus versicolor）具有最强的抑菌效果，其EC50值 为0.237 9 mg/mL，其 次 为 芸 苔 链 格 孢（Alternaria brassicicola）、腐皮镰孢（Fusariumsolani）、尖孢镰孢（Fusarium oxysporum），其EC50值分别为0.368 7、0.507 4、0.899 1 mg/mL，对禾谷镰孢（Fusarium graminearum）的抑菌能力最弱，其EC50值为1.184 4 mg/mL。由图3可知，在低浓度时对腐皮镰孢的抑制活性最好，高浓度时对芸苔链格孢的抑制活性最好。

表 2 纯化后酮类化合物对五种真菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of purified xanthone compounds against 5 fungi

表 2 纯化后酮类化合物对五种真菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of purified xanthone compounds against 5 fungi

菌种 毒力回归方程R2EC50/(mg·mL−1)腐皮镰孢y=0.2104x+0.394 5 0.968 6 0.507 4禾谷镰孢y=0.246 7x+0.207 8 0.960 3 1.184 4尖孢镰孢y=0.404 3x+0.136 5 0.985 1 0.899 1芸苔链格孢y=0.772 8x+0.215 1 0.957 9 0.368 7采绒革盖菌y=0.442 6x+0.394 7 0.989 9 0.237 9

图 3 纯化后酮类化合物对5种真菌的抑制活性Fig.3 Antibacterial activity of purified xanthone compounds against 5 fungi

3 结论与讨论

黄嘌呤氧化酶是体内核酸代谢中重要的酶，能催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸，同时产生过氧化物自由基，尿酸浓度过高将导致高尿酸血症，可引起痛风发作，自由基涉及到炎症等一系列病理过程，抑制黄嘌呤氧化酶的活性，既可以减少体内尿酸的形成，有效地阻止或延缓痛风及其并发症，又可以减少自由基造成的组织伤害[29]；试验研究表明，西南远志中的酮类化合物具有良好的黄嘌呤氧化酶抑制活性，作为黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过阻断次黄嘌呤到黄嘌呤，从黄嘌呤到尿酸的转化来降低血尿酸水平，达到预防和治疗痛风的效果，为云南丰富的远志属植物资源的进一步高效合理利用提供科学依据。