慢加急性肝衰竭小鼠肝组织组蛋白去乙酰化酶mRNA水平变化*

林列坤，卢春生，周应生，郑 义，杨菊红，邹继彬，张仁超，梁旭竞

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)是机体组蛋白乙酰化调节的重要组成部分，乙酰化修饰是目前抗炎治疗研究的新方向[1-3]。HDAC抑制剂被广泛应用于抗炎治疗[4-7]。本文采用D-氨基半乳糖(D-Gal)和脂多糖(LPS)联合诱导建立小鼠慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)模型[8]，观察了HDAC抑制剂干预对小鼠肝组织HDAC mRNA水平的影响，以探讨HDAC在ACLF发病过程中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂、仪器与引物 4周龄SPF级雄性BALB/c小鼠28只，由武汉云克隆动物有限公司提供【动物生产许可证：SCXK(鄂)2015-0091，动物质量合格证编号：42816300001640】，适应性饲养1 w。遵循3R原则使用动物，并经过动物伦理委员会(IACUC)审核批准(编号为：IACU18-0077)； 检测血生化试剂由南京建成生物公司提供；美国Thermo提供RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit为#K1622(第一链cDNA合成试剂)，Roche提供FastStart Universal SYBR Green Master为04913914001(qPCR 染料)及其他一些提取RNA和RNA转录试剂；美国Omni 牌Bead Ruptor 12多样品研磨珠均质仪；北京DragonLab D3024R台式高速冷冻微量离心机；美国ABI 7300荧光定量PCR仪。病理学检测仪器由浙江省金华市科迪仪器设备有限公司提供；qPCR各种引物名称及其序列见表1。

1.2 动物模型的建立 随机将动物分为7组，每组4只。A组：对照组；B组：模型组；C组：曲古抑菌素 A(trichostatin A，TSA)处理组(0.5 mg.kg-1)；D组：大剂量正丁酸钠处理组(2000 mg.kg-1)；E组：小剂量正丁酸钠处理组(500 mg.kg-1)；F组：大剂量NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbarmate, PDTC)处理组(200 mg.kg-1)；G组：小剂量PDTC处理组(50 mg.kg-1)。除A组外，给予其他组小鼠20%CCL4油溶液5 ml.kg-1腹腔注射，2次/w，连续注射12 w，构建慢性肝功能受损小鼠模型。在12 w末，给予不同药物处理组小鼠药物经尾静脉注射，给予A组和B组注射等体积的生理盐水。在药物干预3 d后，给予D-Gal 1 g.kg-1和LPS 10 μg.kg-1腹腔注射，诱发急性肝衰竭，完成构建ACLF小鼠模型。给予各组模型小鼠戊巴比妥注射麻醉，无菌取血和肝脏。取肝组织，经固定、脱水、包埋后，制作石蜡切片，HE染色，显微镜下观察。

1.3 肝组织HDAC mRNA水平检测 采用荧光定量PCR法，取肝组织100 mg，在匀浆器中研磨，得到RNA，加入无RNA酶水15μl溶解RNA，使其终浓度为200 ng/μl。加入RNA溶液2 μg，反转录，获取cDNA。取0.2 ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管： 2× qPCR Mix 12.5μl，7.5μM基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl， ddH2O 8.0μl。95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，60 s，循环40次；再75℃～95℃，每20 s升温1℃。以ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)，B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)， K=A-B ，表达倍数=2-K。

表1 qPCR各种引物名称及其序列

2 结果

2.1 各组小鼠血清AST、ALT和TBIL水平比较 B组血清AST、ALT和TBIL水平显著高于A组(P<0.05)，不同HDAC抑制剂干预组血清AST、ALT和TBIL水平显著低于B组(P<0.05，表2)。

表2 各组小鼠血生化比较

2.2 各组小鼠肝组织病理学表现 A组肝小叶结构清晰，肝细胞呈条索状排列，细胞无肿胀，汇管区无炎细胞浸润；B组表现为肝细胞体积增大，呈弥漫性浊肿，汇管区见融合性坏死，小叶周边充血和炎细胞浸润；C组/D组/E组/F组/G组：肝细胞体积稍增大，轻度浊肿，汇管区见片状或碎片状坏死，少量炎细胞浸润(图1)。

2.3 各组小鼠肝组织Ⅰ类HDAC mRNA水平变化 四种HDAC水平一致，B组较A组显著上升，而C、D、E、F和G组较B组显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05，表3)。

2.4 各组小鼠肝脏组织Ⅱ类HDAC mRNA扩增倍数 除DHAC4和DHAC10外，其他四种HDAC表现一致，B组较A组显著上升， C、D、E、F、G组比B组明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05，表4)。

图1 各组小鼠肝组织病理学表现(HE，200×)

表3 各组小鼠肝组织Ⅰ类HDAC mRNA水平比较

表4 各组小鼠肝组织Ⅱ类HDAC mRNA水平比较

3 讨论

HDAC是机体组蛋白乙酰化水平调节的两大组成之一，它与组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferase，HAT)蛋白结构和酶活性保持高度的平衡[9-11], 称为“乙酰化动态平衡”，对于维持细胞内稳态和平衡有重要的作用[12-15]。文献报道，在疾病发生时，组蛋白乙酰化平衡被打破，HDAC活性或含量升高[16]。本课题按实验设计建立小鼠慢性肝损伤模型，然后给予不同剂量的HDAC抑制剂作为乙酰化调控药物干预模型小鼠，再建立小鼠ACLF模型[8]。检测小鼠肝脏组织Ⅰ类和Ⅱ类HDAC mRNA水平，从而明确HDAC在肝衰竭乙酰化调控过程中的作用。HDACs共有18个成员，包括两大家族，可分为四类[17]。本课题以常见的Ⅰ类和Ⅱ类HDAC为研究内容。

本研究证明HDAC抑制剂的应用保护了肝衰竭动物，改善了肝组织学损伤[18]，再次印证了乙酰化调控能有效保护肝衰竭。急性肝衰竭动物肝组织HDAC mRNA水平显著上升，在乙酰化干预后，各干预组肝组织HDAC mRNA水平显著性下降，与相关研究结论一致。

HDAC代表机体去乙酰化作用。肝衰竭时肝组织HDAC表达上升，机体去乙酰化作用增强。如果乙酰化调控平衡被破坏，使用HDAC抑制剂干预后，肝组织HDAC表达大幅度下降，机体去乙酰化作用减弱，乙酰化作用增强，被破坏失衡的乙酰化动态平衡被调控，再次趋向平衡，这个过程能有效保护肝衰竭动物。由此可见，HDACs对ACLF有促进作用，而HDAC抑制剂对ACLF则具有保护作用。HDAC mRNA是应用乙酰化调节治疗肝衰竭时HDAC转化表达的重要指标，代表肝脏的去乙酰化作用，HDAC mRNA水平越低，表示HDAC表达越低，提示乙酰化调节干预肝衰竭越有效。

从实验结果可见，虽然肝衰竭动物肝组织Ⅰ类和Ⅱ类HDAC mRNA变化明显，但也不是所有的HDAC mRNA均参与了肝脏的乙酰化调控。在Ⅱ类HDAC中，HDAC4和HDAC10 mRNA水平在干预前后改变不明显，可能意味着其在肝脏乙酰化调控中作用不大。所以，我们可以发现，不是所有的Ⅰ类和Ⅱ类HDAC都参与了肝脏的乙酰化调控，各种HDAC的具体功能还有待进一步细化。在本实验D组较E组或F组较G组均使用种类相同而大剂量的HDAC抑制剂，但HDAC mRNA水平未见明显变化。我们认为肝脏启动乙酰化调控是一种特殊的模式，与外加干预的抑制剂种类有关，而与抑制剂的浓度关系不大。

在真核细胞中，乙酰化修饰是最常见的共价修饰，其作用谱广泛，在细胞内发挥重要的修饰作用，目前应用最广泛的为抗炎治疗的应用。本研究应用乙酰化调控干预肝衰竭动物，就是其抗炎功效发挥了作用。HDAC mRNA是乙酰化修饰的负相关指标，在肝衰竭干预治疗过程需要增强机体的乙酰化作用，减弱去乙酰化作用，从而促进肝衰竭病情的缓解[6]。乙酰化调控在肝脏衰竭干预过程中的作用日渐明显，首先通过乙酰化调控降低HDAC mRNA在靶向器官中的表达。在干预肝组织炎症，促进肝脏功能恢复和诱导肝衰竭病情好转方面发挥作用。本研究进一步佐证了控制肝脏的炎症反应能阻断肝衰竭进展。定量检测受损器官HDAC mRNA扩增水平是监测机体乙酰化程度重要的组分。