电针“心俞-神门”对急性心肌缺血模型大鼠心肌与海马组织Glu、Asp和NR1表达的影响

王洁　吴子建　蔡荣林　何璐　余情　刘磊　许静　胡玲

〔摘要〕 目的 觀察电针“心俞-神门”配穴对急性心肌缺血（acute myocardial ischemia， AMI）模型大鼠心肌和海马组织谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA）受体亚基 NMDAR1（NR1）的影响，探讨俞原配穴的协同效应，及其对AMI致脑损伤保护的作用机制。方法 将60只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针“神门”组（神门组）、电针“心俞”组（心俞组）和电针“心俞+神门”组（心神组），每组12只。除假手术组外，其他4组大鼠选用冠状动脉左前降支结扎法建立AMI模型。干预组每天电针治疗1次，20 min/次，共治疗1周，假手术组和模型组不作干预治疗。观察分析心电图ST段变化;ELISA法检测各组大鼠心肌和海马组织中Glu、Asp浓度;实时荧光定量PCR检测各组大鼠心肌和海马组织中NR1 mRNA表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠心电图ST段明显抬高（P<0.01），心肌、海马Glu、Asp浓度和NR1 mRNA表达均显著上升（P<0.01）;与模型组比较，3组电针组治疗后ST段明显降低（P<0.01），心神组心肌和海马Glu、Asp浓度、NR1 mRNA表达均明显下降（P<0.01），神门组、心俞组心肌和海马NR1 mRNA表达及心肌Asp、海马Glu浓度均显著下降（P<0.01）;与神门组比较，心神组心肌Asp浓度和海马Glu、Asp浓度及心肌和海马的NR1 mRNA表达均明显下降（P<0.05或P<0.01）;与心俞组比较，心神组心肌和海马Asp浓度、NR1 mRNA表达明显下降（P<0.05或P<0.01）。Pearson相关分析显示，电针治疗后心肌、海马组织中Glu浓度与NR1 mRNA表达呈正相关。结论 电针俞原配穴“心俞-神门”能够改善AMI模型大鼠心肌缺血状态，降低心肌组织和海马组织的兴奋性氨基酸Glu、Asp和NR1水平，可能是其发挥保护心肌缺血致脑损伤的作用机制之一。

〔关键词〕 心肌缺血;脑损伤;兴奋性氨基酸;电针;心俞;神门

〔中图分类号〕R245.9       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.014

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of electroacupuncture at “Xinshu （BL15）-Shenmen （HT7）” acupoint matching on the glutamic acid （Glu）， aspartic acid（Asp） and the N-methyl-D-aspartate （NMDA） receptor subunit NMDAR1 （NR1） in myocardial and hippocampal tissues of acute myocardial ischemia （AMI） model rats， in order to explore the synergistic effect of acupoint matching of shu-point and source-point and their mechanism in protecting brain injury caused by AMI. Methods 60 healthy male SD rats were randomly divided into the sham operation group， the model group， the electroacupuncture at “Shenmen （HT7）” group （HT7 group）， the electroacupuncture at “Xinshu （BL15）” group （BL15 group）， and the electroacupuncture at "Xinshu （BL15）-Shenmen （HT7）" group （BL15-HT7 group）， with 12 in each group. The AMI model was established by ligation of left anterior descending coronary artery in four groups except the sham operation group. Each intervention group received electroacupuncture treatment once a day for 20 minutes each time for 1 week. The sham operation group and the model group did not receive intervention treatment. The electrocardiogram of rats were recorded， and the changes of ST segment were observed and analyzed; the concentration of Glu and Asp in rat myocardial and hippocampal tissues were determined by ELISA; quantitative realtime PCR was used to detect the expression of NR1 mRNA in the myocardial and hippocamal tissues of rats in each group. Results Compared with the sham operation group， the ST segment of the model group was significantly elevated （P<0.01）， the concentration of Glu and Asp， and the expression of NR1 mRNA in myocardial and hippocamal tissues were significantly increased （P<0.01）; compared with the model group， the ST segment of three groups of electroacupunture were obviously decreased after treatment （P<0.01）， the concentration of Glu， Asp and the expression of NR1 mRNA in myocardial and hippocamal tissues were decreased significantly in the BL15-HT7 group （P<0.01）， the expression of NR1 mRNA in myocardial and hippocamal tissues， the myocardial Asp and the hippocampal Glu concentration were significantly decreased in the HT7 group and the BL15 group （P<0.01）; compared with the HT7 group， the concentration of myocardial Asp and hippocampal Glu， Asp， and the expression of NR1 mRNA in myocardial and hippocamal tissues were decreased significantly in BL15-HT7 group （P<0.05 or P<0.01）; compared with BL15 group， the concentration of myocardial and hippocampal Asp and the expression of NR1 mRNA were significantly decreased in BL15-HT7 group （P<0.05 or P<0.01）. Pearson correlation analysis showed that the concentration of Glu myocardial and hippocamal tissues were positively correlated with the expression of NR1 mRNA after electroacupuncture. Conclusion Electroacupuncture acupoint matching of shu-point and source-point of "Xinshu （BL15）-Shenmen （HT7）" can improve

myocardial ischemia in AMI rats and reduce the concentration of excitatory amino acid Glu and Asp， and the NR1 expression in myocardial and hippocampal tissues， which may be one of the mechanisms of protecting brain damage caused by myocardial ischemia.

〔Keywords〕 myocardial ischemia; brain injury; excitatory amino acids; electroacupuncture; Xinshu （BL15）; Shenmen （HT7）

心肌缺血是指由于心脏冠状动脉供血不足导致的心肌组织缺血缺氧，进而影响心脏功能的病理状态，有研究显示，心肌缺血会造成不同程度的脑损伤，损伤易发生在对缺血较为敏感的海马区，且随着时间的推移不断加重[1]。针刺对心肌缺血的保护作用已得到证实，国内外学者也分别从基因调控、调节心肌能量代谢、调节血管活性物质、调控离子通道等角度对针刺抗心肌缺血的作用及机制进行探讨[2-5]。兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）是中枢神经系统的兴奋性递质，主要是指谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）。Glu和Asp在病理情况下的浓度异常增高，使得氨基酸平衡状态被打破，从而产生兴奋性神經毒性。研究[6]发现，心肌缺血时会释放大量的EAA，尤其是Glu，影响心肌的损伤，心肌缺血细胞损伤的发生与EAA的兴奋性神经毒性有关。本研究通过观察电针俞原配穴“心俞-神门”对急性心肌缺血（acute myocardial ischemia， AMI）模型大鼠心肌组织、海马组织兴奋性氨基酸Glu和Asp及N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA）受体亚基NR1的影响，探讨针刺俞原配穴“心俞-神门”对心肌缺血致脑损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1  实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠60只，体质量（230±20） g，由安徽省实验动物中心提供[许可证号：SCXK（皖）2011-002]，置于康为TR60独立送风隔离笼具中饲养，温度（24±1） ℃，相对湿度为60%，适应性饲养1周。依据随机数字表法，将大鼠随机分为假手术组、模型组、电针“神门”组（简称神门组）、电针“心俞”组（简称心俞组）和电针“心俞+神门”组（简称心神组），每组12只。

1.2  主要仪器和试剂

Powerlab多导生理记录仪（澳大利亚AD Instrments公司）;电子针疗仪（SDZ-V型，苏州医疗用品厂有限公司）;普通PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司）;台式高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）;荧光定量PCR仪（Thermo Scientific）;微孔板迷你离心机（杭州奥盛仪器有限公司）;针灸针（0.3 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司）;大鼠谷氨酸ELISA试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）;大鼠天冬氨酸ELISA试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）;DEPC-H2O（上海捷瑞生物工程有限公司，1910G08）;Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（近岸蛋白质科技有限公司，0516511）;PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（宝日医生物技术有限公司，AJ51485A）。

1.3  模型复制方法

模型复制方法结合前期工作基础并参考文献[7]改良，大鼠术前12 h禁食禁水，用乙醚麻醉大鼠，固定于鼠台，剃去左胸部鼠毛，用碘伏消毒皮肤。沿着大鼠胸骨左侧3 mm处切开皮肤，钝性分离左侧胸肌组织，暴露第2～4肋骨，用弯头止血钳沿3、4肋间迅速撑开肋骨，将心包膜剪开，挤出大鼠心脏，以充分暴露表面血管，找到冠状动脉左前降支，用6/0号医用缝合线进行穿线结扎，然后将心脏放回胸腔中，挤出胸腔残余空气，缝合肌肉皮肤。手术过程中，采用标准Ⅱ导联心电图监控，密切监测大鼠心电图变化。参照前期实验，造模后见心电图ST段上抬，T波高耸，确定大鼠心肌缺血模型形成。假手术组大鼠仅将胸腔打开，在相应部位穿刺不结扎。造模前记录各组大鼠心电图，剔除心电图异常及造模失败大鼠。

1.4  治疗方法

“神门”和“心俞”的腧穴定位参照人体腧穴和《实验针灸学》[8]中大鼠穴位的定位方法。神门穴定位：前肢腕部内侧横纹尺骨边缘;心俞穴定位：第5胸椎棘突下旁开7 mm。选取双侧神门、心俞穴，并在穴位下方1 mm各刺一针作为参考电极。采用1寸一次性无菌针灸针针刺2 mm，接电子针疗仪进行电针刺激，刺激电流2 mA，频率为2 Hz，每日针刺20 min，1周为1个疗程。3组电针组自模型复制后第2天开始治疗，假手术组与模型组大鼠不进行电针治疗。

1.5  观察指标及检测方法

1.5.1  心电图检测与分析  使用Powerlab 8导生理记录仪，观察大鼠肢体标准Ⅱ导联心电信号，并分析ST段变化。

1.5.2  标本采集  7 d电针治疗结束后，各组大鼠禁食禁水，第8天进行取材，每组取材6只。用浓度为10%的水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，5组大鼠断头处死后迅速开颅，将完整的脑组织取出，在冰盘上小心分离海马组织，立即放置液氮内速冻，然后存放于-80 ℃冰箱中待测;迅速取出心脏，冰盘上切取缺血区的0.5 cm×0.5 cm大小心肌组织，用0.9%氯化钠注射液反复冲洗，滤纸吸干液体，放置液氮内速冻后立即置于-80 ℃冰箱中冻存待测。

1.5.3  ELISA试剂盒检测各组大鼠心肌和海马组织中Glu、Asp浓度  将冷冻在液氮中的心脏组织、海马组织解冻，加入PBS溶液充分匀浆，4 ℃、3 000 rpm离心20 min，吸取上清液按照ELISA试剂盒的操作说明书进行检测。

1.5.4  实时荧光定量PCR检测各组大鼠心肌和海马组织中NR1 mRNA表达  取各组50～100 mg组织加入Trizol裂解，提取总RNA。制作cDNA反应液作为荧光定量的模板，取cDNA 1 μL、2×SYBR Green

mixture 5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、RNase Free water 2 μL作为反应体系，反应条件为95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，95 ℃和60 ℃条件反应40个循环。β-actin的引物序列为：（1）上游引物：5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3;（2）下游引物：5-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3，产物长度为150 bp。NMDA-NR1的引物序列为：（1）上游引物：5-GTAAACCAGGCCAATAAGCG-3;（2）下游引物：5-AGACAGGGGTGGGAGTGAAG-3，产物长度为187 bp。目的产物计算方法为2-△△Ct。

1.6  统计学分析

对实验数据采用Graphpad prism 7.0进行统计分析和图形制作，结果以“x±s”表示，组间比较采用单因素方差分析，两两间多重比较采用图凯多重比较测试，采用Pearson相关分析进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1  各组大鼠心电图ST段改变

结果显示，模型复制后大鼠心电图ST段，较假手术组显著抬高（P<0.01），表明急性心肌缺血模型复制成功。与模型组比较，治疗前3组电针组大鼠ST段改变差异无统计学意义（P>0.05），治疗后神门组、心俞组、心神组ST段明显降低（P<0.01）;神门组、心俞组和心神组组间比较ST段的幅值差异无统计学意义（P>0.05）;各治疗组电针后ST段变化与电针前相比，差异均有显著统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.2  各组大鼠心肌组织Glu、Asp浓度比较

ELISA检测可见，模型组大鼠心肌Glu、Asp浓度均明显高于假手术组（P<0.01）;电针治疗后与模型组比较，神门组和心俞组Glu浓度均有所下降，差异无统计学意义（P>0.05），神门组和心俞组Asp浓度均明显降低（P<0.01），心神组Glu和Asp浓度也均显著降低（P<0.01）;与神门组和心俞组比較，心神组Asp浓度明显下降（P<0.01）。见表2。

2.3  各组大鼠海马组织Glu、Asp浓度比较

与假手术组相比较，模型组海马Glu和Asp的浓度均明显上升（P<0.01）;电针治疗后，与模型组相比，心神组Glu、Asp浓度均明显下降（P<0.01），神门组、心俞组Glu浓度均显著降低（P<0.01），神门组、心俞组Asp浓度有所下降，但差异无统计学意义（P>0.05）;与神门组比较，心神组Glu、Asp浓度明显下降（P<0.05）;与心俞组相比，心神组Asp浓度明显下降（P<0.05）。见表3。

2.4  各组大鼠心肌和海马组织中NR1 mRNA相对表达量

与假手术组相比，模型组大鼠心肌、海马组织NR1 mRNA相对表达量均明显上升（P<0.01）;电针治疗后，与模型组相比，神门组、心俞组和心神组心肌、海马组织NR1 mRNA相对表达量均显著下降（P<0.01）;与神门组比较，心神组、心俞组心肌和海马组织NR1 mRNA相对表达量显著下降（P<0.01）;与心俞组相比，心神组心肌、海马组织NR1 mRNA相对表达量均显著降低（P<0.01）。见表4。

2.5  大鼠心肌、海马组织中Glu浓度与NR1 mRNA相对表达量的相关性分析

电针治疗后大鼠心肌组织中Glu浓度与NR1

mRNA相对表达量呈正相关（P<0.01，r=0.836 1），海马组织中Glu浓度与NR1 mRNA相对表达量呈正相关（P<0.01，r=0.874 7）。见图1。

3 讨论

俞原配穴法是在中医基础理论的指导下，与五脏之气输注于原穴和背俞穴的特点相结合，以及针灸“阳中求阴”的原则，将五脏的原穴、背俞穴相配伍，以起到腧穴协同作用，增强疾病治疗效果的配穴方法。《灵枢·背腧》强调“五脏之腧，出于背……心腧在五焦之间”;《针灸甲乙经》中曰：“心……神门者，土也。……手少阴脉之所注也，为俞” ;《针灸大成》曰：“神门：……主疟心烦，……心痛”。心俞作为心之背俞穴、“神门”作为心经原穴，二者具有反应和治疗心脏相关病证的作用。研究[9-10]发现针刺心俞、神门配穴可能通过降低心肌酶、减轻血管内皮损伤、抗氧化应激等作用途径，明显改善心肌缺血损伤，还可降低心肌缺血导致的脂质过氧化损伤、减轻心肌损伤。我们通过前期研究[11-12]证实，针刺通过上调AMI大鼠海马中脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）及其受体酪氨酸激酶B（tropomyosin receptor kinase B， TrkB）和大脑皮质中神经生长因子（nerve growth factor， NGF）及其受体酪氨酸激酶A（tropomyosin receptor kinase A， TrkA）的表达水平，保护心肌缺血所致的脑损伤，这可能是其保护心肌缺血致脑损伤的作用机制之一。此外，我们也发现电针“心俞+神门”俞原配穴对心肌缺血模型大鼠的海马BDNF和TrkB的表达效应优于单穴“神门”，针刺可以诱导分泌内源性BDNF及受体TrkB，起到促进神经元的修复以及保护神经元的作用。

在心肌缺血脑损伤保护作用中除了神经营养因子外，脑内重要的氨基酸类神经递质也发挥着重要的作用。兴奋性氨基酸主要包括Glu和Asp参与神经元的信号传递、学习认知等过程[13]，在心肌能量代谢和心血管保护中具有重要作用[14]。生理状态下具有兴奋性突触传递等作用，而病理条件下，Glu会通过兴奋Glu受体产生兴奋性神经毒性[15]。Glu浓度过高会产生神经毒性，其兴奋毒性的机制，与神经元去极化、神经元肿胀、Ca2+内流和NMDA受体和AMPA受体兴奋激活等过程有关[16]。生理情况下，Glu、Asp为心脏的活动提供能量。Glu在病理状态下的过度升高，可通过受体作用于心肌细胞，导致心电功能紊乱和心脏自律性异常[17]。心肌缺血后大鼠心肌组织中Glu含量大量增高，激活NMDAR，从而引起心肌细胞凋亡，作用途径为GLu-NMDAR-Ca2+[18]。NMDA受体包含3个亚单位：NR1、NR2和NR3，NR1是功能亚基，调节Ca2+通道，与NR2和NR3组成异聚体，形成NMDA受体通道[15]。NMDA 受体过度兴奋会引起一系列的神经损伤。本研究旨在前期工作的基础上，进一步探讨针刺“心俞-神门”配穴对针刺抗心肌缺血脑损伤保护效应的作用机制。

既往研究[19]发现，电针治疗能够上调脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮层区TrkA的表达，同时通过PI3K通路逆转缺血诱导的NR1 mRNA表达的异常增高，使神经兴奋性毒性得到减轻。而NGF及受体TrkA相结合可以促进受损神经元的修复和神经元生长。我们的前期研究也证实了，电针可以提高心肌缺血大鼠皮质区NGF及TrkA的表达，起到抗心肌缺血脑损伤的作用。本研究表明，AMI大鼠模型组心肌组织、海马组织的Glu、Asp含量明显高于假手术组，AMI发生后，心肌缺血缺氧损伤导致Glu、Asp浓度过度升高，NR1 mRNA表达增高，产生兴奋性神经毒性。EAA的兴奋性神经毒性参与了AMI致脑损伤的发生过程。电针治疗后AMI大鼠心肌组织、海马组织中Glu、Asp浓度、NR1 mRNA表达降低，减轻EAA的神经兴奋性毒性，保护神经元。电针俞原配穴“心俞-神门”效果优于单独电针“心俞”“神门”，可见俞原配穴具有协同效应。针刺抗心肌缺血所致脑损伤的作用机制可能与抑制心肌缺血兴奋性氨基酸Glu、Asp及受体NR1过度升高密切相关。本研究结果经Pearson相关分析显示，电针后心肌、海马组织Glu浓度与NR1 mRNA相对表达量呈正相关，表明NR1可能在针刺调节心肌缺血脑损伤大鼠心肌、海马组织Glu浓度中起到重要作用，针刺可能是通过抑制NR1 mRNA表达进而抑制Glu浓度增加，发挥保护心肌缺血致脑损伤的作用。

有研究[20]发现，兴奋性氨基酸Glu与BDNF有密切关系，BDNF可影响Glu的释放和信号传导，还可以增加AMPA受体活性。本课题组后期将从脑源性神经营养因子和兴奋性氨基酸类神经递质作用通路等角度，更进一步探讨针刺抗心肌缺血致脑损伤的效应机制。

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