基于Bax/Bcl-2-Caspase-3通路芍药软肝方抑制裸鼠肝癌生长及机制研究

李骏飞 郑小蓉 姜建伟 章红燕

中國科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）  中国科学院基础医学与肿瘤研究所，浙江杭州   310022

[摘要] 目的 研究芍药软肝方（SRF）调控Bax/Bcl-2-Caspase-3通路抑制肝癌生长的作用及机制。 方法 建立HepG2荷瘤裸鼠模型，随机分为空白对照组、高、中、低浓度芍药软肝方（SRF）组，灌胃3周后称取瘤重，TUNEL法观察肿瘤细胞凋亡情况，Western-blot法检测对组织中NF-κB-p65、VEGF、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白质表达。 结果 （1）不同浓度芍药软肝方（SRF）均可抑制HepG2荷瘤裸鼠体内肝癌肿瘤的生长，并能诱导肿瘤细胞凋亡;（2）SRF可降低裸鼠肝癌组织中NF-κB-p65、VEGF、Bcl-2蛋白表达，上调Bax、Caspase-3蛋白表达。上述作用均呈浓度依赖。 结论 SRF可显著抑制HepG2荷瘤裸鼠肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡，且作用呈浓度依赖。其机制可能通过调控Bax/Bcl-2-Caspase-3通路与抑制信号通路上游NF-κB-p65及VEGF等因子的蛋白质表达有关。

[关键词] 芍药软肝方;肝癌;HepG2;分子机制

[中图分类号] R735.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）07-0038-04

Study of the inhibitory effect of Shaoyao Ruangan Formula on the growth of liver cancer in nude mice based on Bax/Bcl-2-Caspase-3 pathway and its mechanism

LI Junfei   ZHENG Xiaorong   JIANG Jianwei   ZHANG Hongyan

The Cancer Hospital of the University of Chinese Academy of Sciences（Zhejiang Cancer Hospital）， Institute of Basic Medicine and Cancer （IBMC）， Chinese Academy of Sciences， Hangzhou  310022， China

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of Shaoyao Ruangan Formula（SRF） regulating Bax/Bcl-2-Caspase-3 pathway to inhibit the growth of liver cancer. Methods HepG2 tumor-bearing nude mouse models were established and randomly divided into the blank control group， the high， medium and low concentration SRF group. After three weeks of gastric perfusion， the tumors were weighed， the apoptosis of tumor cells was observed through the TUNEL method， and the protein expressions of NF-κB-p65， VEGF， Bcl-2， Bax and Caspase-3 in the tissues of different groups were detected by Western-blot method. Results （1）All SRF at variant concentrations can inhibit the growth of liver cancer in HepG2 tumor-bearing nude mice and induce the apoptosis of tumor cells; （2）SRF can decrease the protein expressions of NF-κB-p65， VEGF and Bcl-2 in liver cancer tissues of nude mice， and up-regulate the protein expressions of Bax and Caspase-3. The above-mentioned effects were all in a concentration-dependent manner. Conclusion SRF can significantly inhibit the growth of tumors in HepG2 tumor-bearing nude mice and promote the apoptosis of tumor cells in a concentration-dependent manner. The mechanism may be related to the inhibition of protein expressions of NF-κB-p65 and VEGF， etc. in the upstream of signaling pathway by regulating Bax/Bcl-2-Caspase-3 pathway.

[Key words] Shaoyao Ruangan Formula; Liver cancer; HepG2; Molecular mechanism

肝细胞癌（以下简称肝癌）是一种发病率与死亡率均较高的恶性肿瘤疾病。据统计，2018年全球肝癌患者新发约84.4万，死亡约78.2万，其新发与死亡比接近1∶1，分列36种常见癌症中的第6位及第4位[1]。我国是肝病大国，肝癌的新发率与死亡率更是常年居高不下，2015年我国肝癌患者新發39.2万余，死亡36.8万余，均位居第3位[2-4]。因此，肝癌的预防、治疗始终是当今医学界重点关注的关键问题之一。

中医中药治疗是公认的有效肝癌防治方式，亦是目前临床抗肝癌药物研发的热点之一。芍药软肝方（Shaoyao Ruangan Formula，SRF）是由我院多位中医师依据临床治疗经验共同总结、研发的中药抗肝癌协定方（当前已开发为院内中药制剂，批准文号：浙药制Z20050184。曾用名：中肝合剂）。全方由白芍、三叶青、重楼、仙鹤草、白茅根、郁金、三棱、路路通等19味中药组成，具有清热解毒、行气健脾等功效，对原发性肝癌疗效显著，受到患者与临床医生的广泛认可，临床使用超过40年[5]。前期实验已证实了SRF具有抗H22肝癌裸鼠肿瘤及延长患癌裸鼠生存期的作用，且初步揭示其抗肿瘤机制可能与抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡相关[6]。但由于H22肝癌属于鼠源性肝癌，与人源性肝癌有较大差异，且SRF的抗肿瘤作用及机制至今尚未被完全阐明。因此本研究在前期研究基础上，以人源性HepG2细胞及相应裸鼠肝癌移植瘤模型为载体，围绕SRF对Bax（BCL-2-associated X protein）/B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）-半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）通路及上游细胞核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）-NF-κB-p65及血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的调控作用而进一步阐释该方抗肝癌的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 动物与瘤株  裸鼠20只，均3周龄，体重（20±2）g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物公司提供，生产许可SCXK（沪）2017-0005。HepG2细胞株由中国科学院上海细胞库提供。

1.1.2 实验药物制备  芍药软肝方由中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）提供，药物低、中、高浓度为5 mL/kg、10 mL/kg、20 mL/kg。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器  DnaseI（Promega）、Bst DNA Polymerase（NEB）、总蛋白提取试剂盒（南京凯基生物）、BCA蛋白定量试剂盒（天根）、PVDF（merck）、SDS-PAGE制备试剂盒（杭州宝赛生物）。美国Agilent Stratagene Mx3005P荧光定量PCR仪、Bio-RAD垂直蛋白电泳和转膜仪、美国Bio-RAD公司Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis system、Bio-RADMini-sub cell GT水平电泳槽、AndyBio M-centrifuge微型离心机。Bcl-2抗体（艾博抗上海贸易有限公司），批号ab692;Bax抗体（艾博抗上海贸易有限公司），编号ab7977;VEGF抗体（艾博抗上海贸易有限公司），编号ab69479;Caspase-3抗体（艾博抗上海贸易有限公司），批号ab32351;NF-κB-p65抗体（艾博抗上海贸易有限公司），批号ab76302;β-actin抗体（艾博抗上海贸易有限公司），批号ab63982。

1.2.2 模型制备及分组  培养HepG2细胞至对数期，超净台内无菌条件下生理盐水稀释配制成细胞悬液备用。取裸鼠，左腋下注射2×107个HepG2细胞，制备HepG2肝癌裸鼠模型，共20只。实验共分为四组，每组5只，分别为SRF高、中、低剂量组及空白对照组，给药组按剂量每日灌胃1次，空白对照组给予10 mL生理盐水灌胃，连续给药3周后处死裸鼠。

1.2.3 取材  摘除裸鼠移植瘤，拍照、称重，将非坏死部分冻存。

1.3 观察指标

1.3.1 TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡  取肝脏肿瘤组织置10%甲醛溶液中固定，脱水后石蜡包埋并常规切片。按试剂盒说明书提示步骤操作对石蜡切片进行检测，以细胞核染成绿色的细胞为凋亡细胞，显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.3.2 Western-blot法检测肿瘤组织中VEGF、NF-κB-p65、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白质表达  取肿瘤组织0.5 g制备细胞裂解液，按照全蛋白提取试剂盒提示按步骤提取样品总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定浓度，20 μg蛋白质SDS-PAGE电泳，转模，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。一抗室温孵育2 h，TBST漂洗滤膜3次，每次10 min，TBS洗涤1次10 min。二抗室温孵育1 h，TBST洗涤液洗涤3次，每次10 min，TBS洗涤1次10 min。DAB显色液临用时配制。洗净后的PVDF膜放入显色液中反应3 min（注意观察），用水终止反应，成像仪摄片，测定肿瘤组织中VEGF、NF-κB-p65、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白质表达。

1.4 统计学方法

实验数据使用SPSS 23.0统计学软件进行处理，计量资料以（x±s）表示，多组间资料比较采用方差分析，两组比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SRF各组干预HepG2荷瘤裸鼠肿瘤重量比较

SRF给药组肿瘤体积及重量均小于空白对照组。空白对照组裸鼠平均瘤重为（1.73±0.28）g、低剂量组瘤重为（1.10±0.17）g、中剂量组瘤重为（0.78±0.03）g、高剂量组瘤重为（0.45±0.04）g，其中中、高剂量组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明中、高浓度SRF具有显著抑制HepG2荷瘤裸鼠肝癌生长的作用，且呈濃度依。

2.2 SRF各组干预HepG2荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞凋亡情况比较

TUNEL法检测镜下空白对照组荧光细胞仅零星可见，说明仅有少量细胞凋亡。SRF各组荧光细胞均明显多于空白对照组，且凋亡细胞数量随药物浓度升高而增多，高浓度组已呈现大片荧光细胞，说明肿瘤细胞凋亡程度最高。

2.3 Western-blot实验

与空白对照组相比，SRF各组干预后肿瘤组织样本中VEGF、NF-κB-p65、Bcl-2等因子蛋白质表达水平降低而Caspase-3及Bax因子蛋白质表达水平提高，且均呈浓度依赖。

3 讨论

肝癌的发生、发展或转移受到多因素、多阶段、多基因的共同调控[7]。肿瘤细胞出现凋亡抑制及失控性无限制增殖被视为肝癌发生与恶化的重要机制[8]。Bax和Bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白家族的成员，在细胞凋亡的调控中发挥着重要作用。Bax与Bcl-2是一对具有相互拮抗作用的同源调控因子，它们形成二聚体后通过改变线粒体外膜的通透性诱导细胞凋亡[9，10]。Bax又称造孔蛋白，激活后在线粒体膜外膜形成孔洞，导致膜完整性丧失和细胞色素释放[11]，因此Bax是重要的促凋亡因子，参与线粒体凋亡途径，而抗凋亡因子Bcl-2可抑制Bax的功能。简言之，Bax可促进细胞凋亡，Bcl-2则抑制凋亡，Bax及Bcl-2间的比率决定了它们诱导凋亡作用的强弱，当Bcl-2表达显著增加时，肿瘤细胞将表现出明显的凋亡抑制现象[12，13]。Caspase是细胞凋亡通路中另一类关键调控因子，它们具有促细胞凋亡作用[14]，通常可分为启动型，包括：Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10和效应或执行型，包括：Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7[15]。当Bax/Bcl-2二聚体中Bax表达增加时将激活Caspase-9，然后Caspase-9又通过酶切酶原激活Caspase-3，促使Caspase-3进行剪切，从而开启凋亡级联反应，催化多种关键细胞蛋白分解，使细胞凋亡[16，17]。因此，Bax/Bcl-2-Caspase-3是肿瘤细胞凋亡过程中常见的重要调控因子[18]。

NF-κB是一种由50 ku和65 ku蛋白组成的异源二聚体，在正常条件下与IκBs形成复合物，保持在静息状态[19]。当受到外界因素，如缺氧、细胞因子、病毒蛋白、有丝分裂原和紫外线等刺激时，IκBs被降解，形成三聚体复合物中的IκB被磷酸化，与NF-κB解离，随后NF-κB进入细胞核，作用于靶因子，发挥其功能[19-20]。NF-κB是一种具有多向调节功能的转录因子，可调控多种基因的表达，如凋亡相关基因、癌基因、肿瘤转移相关黏附分子、细胞外基质蛋白酶等，尤其是上调VEGF基因的表达，在肿瘤细胞的发展过程中扮演重要作用，与肿瘤的发生、浸润和转移密切相关[21]。研究表明，NF-κB活化在肝癌发生发展中起着关键的作用，是肝癌细胞凋亡的关键因子[22-23]。活化的NF-κB可增加抗凋亡基因Bcl-2的表达，抑制促凋亡蛋白Bax表达[24]。因此Bax/Bcl-2-Caspase-3信号通路受到NF-κB及VEGF等上游因子的调控。实验发现当NF-κB表达受到抑制时，Bax/Bcl-2-Caspase-3通路中Bax及Caspase-3等促凋亡因子表达将显著上调，进而促使肿瘤细胞凋亡[25]。VEGF是促进肿瘤周围及新血管生成、控制肿瘤微环境的关键调控因子，在肝癌中呈高表达，对肿瘤的发生、发展及凋亡均有重要作用[26]。研究表明，当肿瘤细胞出现缺氧适应性反应时，缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）/VEGF通路被激活，继而通过调控Bax/Bcl-2/Caspase-3通路促使肿瘤细胞出现凋亡抑制反应[27]。Song等[28]研究则进一步阐明，ROS-NF-κB信号通路位于HIF-1α/VEGF通路上游，并对其具有调控作用。因此，认为在肝癌的发生及恶性化过程中可能存在NF-κB/VEGF/Bax/Bcl-2-Caspase-3信号通路调控肝癌细胞的凋亡机能。

SRF全方由19味中药组成，其中麸白芍、郁金柔肝利胆，行气解瘀，重楼、白花蛇舌草、白毛藤、三叶青、半枝莲解毒散结，清热消肿，莪术、三棱行气化瘀，破血消积，金钱草、白茅根利尿消肿，陈皮、青皮理气降逆，焦山楂、炒鸡内金消积健脾，以其为基础开发的院内制剂芍药软肝合剂一直是我院治疗肝癌的临床常用药物之一，深受医师及患者青睐，但其作用机制尚未阐明。基于芍药软肝方在临床中的疗效，本文设计了相关实验，利用各种实验方法探讨其在动物水平方面研究其抗肿瘤机制。最终本实验结果发现，SRF可显著抑制HepG2荷瘤裸鼠肿瘤组织生长，且抑制效果呈浓度依赖性，其中以高浓度SRF作用最强。TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡发现，不同浓度的SRF都可以促进HepG2细胞的凋亡，也随着浓度的增加而加强。Western-blot研究显示SRF可抑制肿瘤组织中NF-κB、VEGF及Bcl-2蛋白表达，上调Bax、Caspase-3蛋白表达。

綜上所述，SRF在动物水平可起到较好的抗肿瘤作用，其机制可能通过抑制肿瘤细胞NF-κB及VEGF的蛋白质表达来调控Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

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（收稿日期：2020-05-06）