弥河沉积物的反硝化和厌氧氨氧化过程

李佳霖,秦 松

弥河沉积物的反硝化和厌氧氨氧化过程

李佳霖1,2,秦 松1,2*

(1.中国科学院烟台海岸带研究所海岸带生物学与生物资源保护实验室,山东 烟台 264003；2.中国科学院海洋大科学研究中心,山东 青岛 266071)

本研究选取弥河4个站点为研究对象,在不同季节分别采集沉积物样品,测定理化指标,并采用同位素配对技术和分子生物学方法,研究了沉积物中的反硝化和厌氧氨氧化作用及其影响因素.结果表明,弥河沉积物中的反硝化速率变化范围为151.75~2847.86μmol/(m2×h),厌氧氨氧化速率的变化范围为149.57~2109.17μmol/(m2×h),厌氧氨氧化在氮去除中的贡献量平均达到56.1%.沉积物中的反硝化细菌以K型为主,丰度为0.19×106~5.12×106个/g,主要是-和-变形菌门;厌氧氨氧化细菌以A为标记基因的丰度范围是2.58×102~1.14×104个/g,主要为浮霉菌门的属细菌.反硝化速率与沉积物中的TN含量和间隙水PO43-呈正相关关系,厌氧氨氧化作用与沉积物中的TN含量呈正相关,而与沉积物密度呈负相关关系,沉积物的理化指标是决定氮去除速率的主要环境条件.弥河的反硝化和厌氧氨氧化作用明显,对减轻氮超标具有重要意义,合理改变沉积环境是有效提高氮去除速率的可参考方式.

反硝化作用；厌氧氨氧化作用；功能微生物；影响因素；弥河

受人类活动的影响,世界范围内的近海入海河流普遍存在无机氮污染的环境问题.根据美国环境保护署2012年的调查报告,全美河流41%的河段氮含量较高;在我国实施监测的55条入海河流中,过半数河流入海断面水质劣于V类地表水水质标准,主要污染要素中包括氨氮[1].无机氮污染不仅会造成区域性河流的富营养化,而且随河流入海后将产生近海海域严重的生态问题,如生物多样性降低、发生有害藻华甚至出现低氧“死区”[2-3].无机氮污染主要来源于非点源的农业化肥,由于未能有效利用,全球超过一半的施用化肥排入河流,而随着粮食需求及施肥强度的加大,未来全球范围内排入河流的氮总量仍将增加[4],因此对河流生态系统中无机氮的生物地化循环进行研究具有重要意义.

微生物介导的无机氮生物地化循环过程包括固氮、硝化、硝酸盐异化还原成铵、反硝化和厌氧氨氧化等作用[5].其中,河流的反硝化和厌氧氨氧化过程将无机氮转化为氮气和氧化亚氮,可以实现流域中无机氮的去除,既是计算氮循环通量的关键内容,也是潜在治理氮富营养化、实现生态修复的有效途径.反硝化和厌氧氨氧化是厌氧反应过程,普遍存在于水体悬浮颗粒物、沉积物环境中,在河流中去除氮的贡献量达到40%~80%[6].利用同位素配对技术对反硝化和厌氧氨氧化进行测定,发现多数河流沉积物的反硝化作用占主要贡献量[7-9],但随着无机氮浓度的升高,提供反硝化作用所需电子的有机物相对不足,厌氧氨氧化作用会成为无机氮去除的主要过程[10].研究发现河流中的环境因子,包括盐度、无机氮、有机质、沉积物的理化特征与反硝化和厌氧氨氧化速率均存在相关性[11-13];同时由于是微生物介导的过程,反硝化和厌氧氨氧化细菌的丰度和多样性能够直接影响反应速率[14-16].由于河流的环境条件变化较大,反硝化和厌氧氨氧化速率及其主要的影响因素也存在明显差异.

弥河是莱州湾南岸的主要入海河流之一.受温带季风气候冷暖气流的影响,弥河具有我国北方河流的显著特点,即春秋旱易形成断流现象、夏季降雨较多流量激增、冬季少雪存在冰期.由于常年开采地下水用于城市供水及农业生产,造成流域内大范围的地下水超采,弥河中下游的咸水入侵较为严重,河水的盐度尤其是在旱季有显著升高[17].弥河上游的寿光是北方重要的蔬菜生产基地,中下游流经化工产业园,大量工农业含氮污水及沿岸生活污水造成弥河的氮污染较高[18].弥河入海后汇入莱州湾,莱州湾尤其是西部海区水体呈现严重的氮富营养化状态,其主要的来源是沿岸河流的输入[19].本研究通过对弥河沉积物的反硝化和厌氧氨氧化过程向河水中释放氮气通量的研究,探讨了其对流域氮循环过程的影响;同时对沉积物中反硝化和厌氧氨氧化功能菌群的丰度和多样性进行分析,结合环境因子,评估了影响沉积物反硝化和厌氧氨氧化速率的影响因子.本研究结果深化了河流中对氮自去除过程的认识,有助于实现氮收支的核算,为河流富营养化的生态治理和修复提供科学参考.

1 材料与方法

1.1 研究站位与样品采集

弥河主要的环境问题是咸水入侵和氮富营养化,咸水入侵造成沉积物生境的显著变化.根据咸水入侵范围[17]和主要陆源污染输入地域,沿弥河选取4个采样站位,分别位于卤水区的弥河桥下(M1)、咸淡水混合区的南半截河村(M2)、张家北楼村(M3)和入侵范围外的寿光市内(M4),于2012年4月、8月和10月进行了春、夏和秋季的调查和采样(图1).由于采样年份冬季弥河存在冰期,本研究未对弥河进行冬季的研究.

沉积物样品采集于河边浅水浸没区,采取多点取样法.用有机玻璃柱(长度20cm,直径3.4cm)采集表层5cm沉积物柱样,每个站位采集12个平行样,上下部用胶塞塞好;采集采样点原位水2.0L,用0.22μm滤膜过滤水样后装入灭菌广口瓶中,于4℃保温箱保存带回实验室,用于反硝化和厌氧氨氧化通量测定培养实验[20].用无菌针筒采样管采集表层5cm沉积物保存于4℃保温箱,用于间隙水营养盐、孔隙度、密度、含水量、有机碳、总氮和粒度测定,采集表层5cm沉积物保存于液氮中带回置于-80℃冰箱中,用于功能群落丰度和多样性分析[21].

图1 采样点分布

★为采样点

1.2 环境因子测定

河水的温度、盐度和pH值在采样现场用YSI556MPS采集数据.密度和含水率采用称量法测定.沉积物粒度采用激光粒度仪直接测定(Matersizer 2000F laser particle size analyzer, Malvern, England). 间隙水经离心采集后用连续流动分析仪(AAA3, Seal Analytical GmbH, German)的标准方法进行测定[22].元素分析仪 (Elementar, Vario Micro, German)用于测定沉积物的有机碳和总氮.重金属含量采用ICP-MS (PerkinElmer, Elan DRC II, Hong Kong)测定.所有环境参数进行3个重复测定,结果取平均值.

1.3 反硝化与厌氧氨氧化速率测定

反硝化和厌氧氨氧化速率采用同位素配对技术通过培养实验的方法进行测定.将采集的沉积物带回实验室后插入培养箱中,在有机玻璃管内注满原位采集的上覆水,密封平衡24h.将培养管分为2组,每组6个,室温下培养,分别加入125和250μL的Na15NO3溶液(0.1mol/L,99.5%15N,Sigma),培养管用带磁转子的胶塞封住,在磁转子60r/min条件下放置0.5h使15NO3－在培养体系中均匀分布.培养0时刻,在对照组6个培养管中加入0.5mL的ZnCl2(50%,/)溶液,培养3h后,在对照组6个培养管中加入0.5mL ZnCl2溶液,混匀后取上层泥浆样品12.5mL放入容量瓶(Labco, UK),加入100μL ZnCl2溶液密封保存.培养样品中的28N2、29N2和30N2含量比值利用氦气顶空平衡法抽取出顶空气体,采用稳定同位素质谱仪(Gasbench-MAT253, Thermo Fisher, USA)测定[20],计算公式如下[23]:

式中:是不同浓度15NO-添加体系中15NO-浓度的比值;29N2是29N2-N生成量,μmol;30N2是30N2-N生成量,μmol;(1)和(2)分别表示加入125和250μL Na15NO3的培养体系;14是还原体系中14NO-/15NO-的比值;14是N2-N实际生成量,μmol;28是厌氧氨氧化作用生成的28N2的量,μmol;28是反硝化作用生成的28N2的量,μmol.

1.4 功能微生物丰度与多样性

称取0.50g沉积物样品,用土壤DNA提取试剂盒(Mobio, USA)提取DNA,并将平行的3个样品混合后进行后续PCR反应.用反硝化细菌亚硝酸盐还原酶的编码基因S和K及厌氧氨氧化功能基因片段A的特异性引物进行片段扩增,引物及反应条件见表1.用绝对实时定量PCR方法测定样品中的功能基因丰度,并以沉积物湿重计量.用变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法对功能菌群多样性进行聚类分析,选取样品用克隆建库方法分析功能基因的群落结构和组成.功能基因序列提交NCBI数据库,S和K的序列号分别为MT532558 - MT532658和MT532681 - MT532729,A的序列号为MT532659 - MT532680.测定的功能基因序列通过Mothur采用最远邻算法进行操作分类单元(OTU)分类,翻译为相应的氨基酸序列,与GenBank数据库中相关氨基酸的近似序列进行比对,并采用最大似然法用Mega-X构建系统发育树.

表1 反硝化和硝化作用功能基因片段引物序列信息

1.5 统计分析方法

单因子方差分析用于检验环境因子、功能菌群丰度及氮去除速率是否存在显著性差异,<0.05表示两者间存在差异,<0.01表示两者间存在显著性差异.采用皮尔逊相关系数衡量变量间的线性关系.通过多元回归方法分析上覆水、沉积物和间隙水的理化性质及功能细菌丰度对反硝化作用和厌氧氨氧化作用变化的影响[28-29].

2 结果与讨论

2.1 弥河主要环境因子

环境条件通过影响微生物的种群丰度和结构,制约生化反应速率,进而影响微生物参与的生物地化循环作用过程.弥河样品环境因子数据见表2,各因子在站位和季节间存在较大差异.研究站位上覆水的盐度显示,弥河研究河段尽管处于咸水入侵区附近,但盐度相比于同样处于咸水入侵区的小清河(2.73‰)和胶莱河(7.96‰)偏低[30];所有样品的pH值均偏碱性,平均值为8.57.沉积物间隙水中无机氮NH4+-N和NO3--N含量均值为0.534和0.397mg/L, NH4+-N含量随季节变化较大,春季明显较高; PO43-P的含量较低,与无机氮的浓度相比差异明显偏低,是沉积物生态环境的主要限制因子;沉积物中重金属含量较高,按重金属的物质的量浓度比较,Zn的浓度最高,其次是Cu, Pb和Cr的浓度较低.

弥河处于明显的季风气候区,夏季雨水充沛,径流量上升,上覆水盐度夏季偏低,但站位间和季节间的环境因子差异并不显著.

表2 站点上覆水、沉积物和间隙水的物理化学性质

2.2 反硝化和厌氧氨氧化速率

如图2所示,弥河的反硝化速率范围为151.75~ 2847.86μmol/(m2×h),均值为680.83μmol/ (m2×h),季节间差异较为显著(=0.02,=7.39),春季的反硝化速率明显较高,平均达到1512.58μmol/(m2×h),夏秋季则相对较低.厌氧氨氧化速率范围为149.57~ 2109.17μmol/(m2×h),均值为898.32μmol/(m2×h),也表现出较为显著的季节间差异(=0.04,=6.01),春季最高,夏季较高,秋季则最低.弥河厌氧氨氧化在氮去除中的贡献量是42.5%~78.0%,平均达到56.1%,说明在弥河的无机氮去除过程中,厌氧氨氧化过程与反硝化过程的贡献量相当,两者都是氮去除的重要过程.

反硝化作用是在厌氧条件下NO3-经多步反应依次还原为NO2-、NO、N2O,最终生成N2(或不完全反应条件下终产物为N2O)的过程.弥河的反硝化作用速率与三峡库区小江支流泄水期的速率相当[647.20μmol/(m2×h)],与小江支流蓄水期的速率[24.04μmol/(m2×h)]和淀山湖区的速率[14.60μmol/ (m2×h)]相比较高[31-32];对全球河流沉积物的反硝化作用估算范围是100.00~685.71μmol/(m2×h)[33],与之相比弥河的反硝化作用速率春季明显偏高,夏秋两季处于正常范围内.弥河的厌氧氨氧化速率经沉积物密度值换算后均值约为11.2nmol/(g×h),与长江口低盐度河域[0.23nmol/(g×h)]和美国的Cape Fear河的速率[0.17~4.77nmol/(g×h)]相比偏高[34-35].而白洋淀河畔的速率是7~20nmol/(g×h),与弥河速率相当.弥河较高的厌氧氨氧化速率造成其相对贡献量也较高,而珠江河口、白洋淀河畔和法国的Seine湾厌氧氨氧化过程的贡献量分别是3.8%~7%[7],11%~ 35%[8]和3%~8%[9],其氮去除过程均以反硝化过程为主.厌氧氨氧化过程的贡献量较高可能与河水沉积物中NO3-含量较高,而有机碳含量相对不足有关[36].

2.3 反硝化细菌丰度与功能基因多样性

亚硝酸盐还原为NO既是反硝化过程的重要限速步骤,也是反硝化过程区别于其它硝酸盐代谢的标志性反应,其功能酶即亚硝酸盐还原酶(Nir)包括K和S,分别是铜型亚硝酸盐还原酶和细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶,是反硝化微生物的重要分子标志物[37].弥河的反硝化细菌丰度如图3(a)所示,其中K型丰度范围是0.19× 106~5.12×106个/g,均值为1.38×106个/g;S型丰度范围是7.19×103~2.23×105个/g,均值为8.41× 104个/g.反硝化细菌以K型为主,丰度约是S型的16倍.一般较浅的河流中K型反硝化菌是主要类群,而湖泊和海湾中S型反硝化细菌则是主要类群[31],主要原因是S反硝化细菌对环境因子的变化更敏感,河流出现断流现象造成的表层沉积物条件的改变,以及河流氮富营养化造成的相对磷限制,会显著影响S型反硝化细菌丰度[38].

DGGE的条带图谱如图3(b)所示,根据条带位置和丰度计算香农指数的范围分别是2.64~3.08和1.32~2.42.K型反硝化细菌相似度范围是34.9%~ 69.2%;在相似度40%条件下聚类为3类,季节差异性高于采样点间的差异性.而S型反硝化细菌所有站位的相似度范围是8.1%~52.1%,在相似度10%条件下聚类成2类,样品的季节和采样点间差异均较大,反映出弥河的反硝化细菌中K型的多样性明显较高,且主要随季节变化有所差异,而S型反硝化细菌样品间差异更大,说明其群落组成波动较大.

图3 反硝化细菌功能基因nirK和nirS丰度、聚类分析及系统进化树

4,8,10表示采样时间为4月、8月、10月,下同

选取M1-4、M3-8和M2-10样品构建弥河K型反硝化细菌功能基因的克隆文库(图3c).以阳性克隆的菌株进行测序,并将测序结果的氨基酸序列与Pfam数据库进行比对确认,共获得101条K功能基因序列,不同序列间的相似性为32%以上.在80%相似度下,共获得23个OTU,以的亚硝酸盐还原酶A的氨基酸序列为外群,构建了K功能基因氨基酸序列的系统进化树.弥河K型反硝化细菌的相近序列为-和变形菌门,相近序列多为不可培养的环境细菌,来源包括农田土壤、活性污泥、生物膜反应器、以及湖泊和近海的沉积物.S型反硝化细菌在弥河沉积物中的占比较低,以M3-8样品构建了克隆文库,共获得49条功能基因序列,不同序列间的相似性达到45%以上.按照80%相似度共获得15个OTU,以IM2的亚硝酸盐还原酶氨基酸序列为外群,与相近序列编码的氨基酸序列构建了系统进化树.S型反硝化细菌的相近序列包含-、和-变形菌门,相近序列都来自于不同河流和河口的沉积物.

2.4 厌氧氨氧化细菌丰度与功能基因多样性

联氨合成酶Hzs是亚硝酸盐还原成NO后与NH4+合成联氨即肼(NH2NH2)的功能酶,其编码基因A是厌氧氨氧化细菌的分子标志物,常用于研究厌氧氨氧化细菌的群落组成和环境丰度[27].弥河的A基因丰度如图4(a)所示,范围为2.58×102~ 1.14×104个/g,均值为2.04×103个/g,与东江河[39]、珠江入海口[40]及法国Cape Fear河[41]的厌氧氨氧化细菌丰度相比偏低约一数量级.本研究中以联氨氧化酶功能基因AB为标志物对厌氧氨氧化细菌进行了目标基因扩增,但未获得目标条带.

已知的厌氧氨氧化细菌均属于浮霉菌目(Planctomycetes),由于其A序列差异较小,DGGE条带分离不明显,直接选取M3-8和M2-10的样品构建了克隆文库,验证了弥河厌氧氨氧化细菌的存在及优势种群.测序共获得22条A序列,不同序列间的相似性为19%以上,3%相似度下共获得10个OTU.通过与NCBI数据库A基因氨基酸序列比对,发现均为“”属,以另一主要属的A氨基酸序列为外群,构建系统进化树(图4b).在珠江口入海断面沉积物厌氧氨氧化细菌多样性的研究也发现,盐度较低的站位中,属厌氧氨氧化菌是优势种群[42].

图4 厌氧氨氧化细菌功能基因hzsA丰度及系统进化树

2.5 影响反硝化和厌氧氨氧化速率的主要因素

弥河的反硝化和厌氧氨氧化作用具有协同性,两者显著正相关,相关系数为0.72(=0.008).Zhou等[43]的研究发现,通过氯酸盐抑制反硝化NO3-还原为NO2-的步骤,反硝化作用和厌氧氨氧化作用均会显著降低,说明在NO2-含量较低的沉积环境中,厌氧氨氧化作用的进行依赖于反硝化作用第一步还原反应生成的NO2-,在长江口河域[44]以及沉水农田[37]中均观测到厌氧氨氧化作用与反硝化作用的关联性.目前在氮富营养化严重的河道,依赖反硝化的厌氧氨氧化作用作为生物修复手段被证实是同时去除NO3-和NH4+的有效途径[45].

弥河的反硝化作用与沉积物间隙水中的PO43-呈显著正相关(= 0.76,= 0.005),与沉积物的TN呈正相关(= 0.63,= 0.029);厌氧氨氧化作用与沉积物的TN呈显著正相关(= 0.85,= 0.001),与沉积物密度呈负相关(= - 0.66,= 0.018).沉积物中的N素是氮去除过程的主要底物,是影响弥河反硝化和厌氧氨氧化速率的主要环境因子.受农业施肥非点源污染的影响,河流湖泊和近岸水体表现为磷限制的富营养化,氮磷比极高,磷成为重要的限制因子.在磷酸盐限制条件下,反硝化作用将受到抑制,这一现象在磷限制水体的室内培养实验中也得到证实,在PO43-浓度低于0.15mg/L时通过填加磷酸盐可以显著提高反硝化作用的速率,可能的原因是磷限制了反硝化细菌的生长尤其是反硝化聚磷菌这一类对磷酸盐有较高依赖性的菌的生长[46].密度是沉积物重要的物理指标,但其对微生物及其地化循环的影响认知还较少,可能与厌氧氨氧化作用的底物NO2-来源于反硝化作用中间过程有关,沉积物的物理性质影响了NO2-在功能细菌间的输运.

对上覆水、沉积物和间隙水的理化性质及功能细菌丰度对反硝化作用和厌氧氨氧化作用变化的影响分析发现沉积物的理化性质是影响反硝化作用和厌氧氨氧化作用的主要解释因子,2分别为0.656和0.593,而功能细菌丰度的影响均较小.自然河流中,由于环境条件的波动性较大,细菌的生长和生理活动都会受到环境因子的限制,因此功能细菌和相应生态功能速率间的相关性并不显著,在长江流域的河流中也发现沉积物的反硝化作用与细菌群落间不存在相关性[14].弥河的反硝化和厌氧氨氧化作用去除氮的效率主要取决于沉积物的理化性质,这一结果可以指导弥河富营养化的修复工作.

3 结论

3.1 弥河沉积物中存在反硝化作用和厌氧氨氧化作用,反硝化速率范围为151.75~2847.86μmol/(m2×h),不同季节的均值为680.83μmol/(m2×h),厌氧氨氧化速率范围为149.57~2109.17μmol/(m2×h),不同季节均值为898.32μmol/(m2×h),两者在氮去除过程中的贡献量相当.

3.2 弥河沉积物反硝化作用的功能细菌以K型为主,丰度0.19×106~5.12×106个/g,S型则较少,丰度范围是7.19×103~2.23×105个/g,反硝化细菌主要为-和变形菌门;厌氧氨氧化细菌以A为基因标记的丰度为2.58×102~1.14×104个/g,主要是浮霉菌门的类群.

3.3 弥河的反硝化和厌氧氨氧化作用具有协同性,依赖于反硝化的厌氧氨氧化作用可能是弥河沉积物厌氧氨氧化作用的主要机制.沉积物的理化性质是解释弥河反硝化和厌氧氨氧化速率差异的主要环境因子,其中TN作为反硝化作用和厌氧氨氧化作用的底物,与两个过程呈正相关关系,此外PO43-浓度较低,作为环境限制因子与反硝化作用呈显著正相关关系,而沉积物密度与厌氧氨氧化作用呈负相关关系.

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Denitrification and anammox processes in sediment of Mihe River, China.

LI Jia-lin1,2, QIN Song1,2*

(1.Laboratory of Coastal Biology and Bioresource Protection, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China；2.Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)., 2021,41(4)：1588~1596

Four sites were selected along Mihe River to sample the sediments and characterize physiochemical property to reveal denitrification/anammox processes and their constraints by isotope tracing experiment and molecular biological analysis. The results showed that the rates of denitrification varied from 151.75 to 2847.86μmol/(m2×h), and the anammox rates were in the range of 149.57 to 2109.17μmol/(m2×h). The relative contribution of anammox in the nitrogen removal was in an average of 56.1%. TheK type was the dominant denitrifier with the abundance of 0.19´106~5.12´106copies/g in the sediment, which was in the phylum of- and- Proteobacteria. The anammox bacteria marked byA gene was in the range of 2.58´102~1.14´104copies/g, which belonged to the Ca. Brocadia clades in Planctomycetes. Furthermore, the denitrification rate was positively related with TN content and PO43-concentration, while the anammox rate was positively related with TN content and negatively related with sediment density. The physiochemical property of sediment was the main condition determining the nitrogen removal rates. The results highlight that denitrification and anammox were of great significance to reduce nitrogen eutrophication, and sediment environment treatment was a considerable way to regular nitrogen removal rate.

denitrification；anammox；functional bacteria；impact factor；Mihe River

X524

A

1000-6923(2021)04-1588-09

李佳霖(1980-),女,山东烟台人,副研究员,博士,主要从事环境微生物生态学研究.发表论文12篇.

2020-08-10

国家自然科学基金资助项目(41106100)

*责任作者, 研究员, sqin@yic.ac.cn