微藻合成生物技术发展总结与展望：从底盘细胞到光合生物制造

栾国栋，张杉杉，吕雪峰，2

（1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所中国科学院生物燃料重点实验室，青岛266101；2.中国科学院洁净能源创新研究院，大连116023）

微藻广泛分布于各种生态环境，为地球生物圈提供了重要的初级生产力，是研究光合作用的重要模式体系，也是极具潜力的微生物光合制造平台［1⁃4］。传统微藻应用技术开发的方向是：筛选、养殖优质微藻进行油脂和高附加值天然产物的合成，并结合下游采收提取技术的开发来降低成本、提升效益。该技术模式体系成熟，但用于所采用的天然藻株遗传背景复杂、改造困难，产品类型极为有限［5］。近年来，合成生物技术的发展使得重塑微藻光合生理模式和代谢网络进行生物能源和生物基化学品合成成为一条新的微藻生物技术发展路线。以可进行遗传操作的模式藻株为平台，通过外源代谢途径的导入和背景代谢网络的改造，目前已经实现了烃、糖、醇、酮、酸、萜类以及脂肪族化合物等数十种天然和非天然代谢产物的光驱固碳合成［6］。这种以光合微藻为底盘，通过光合固碳过程，将太阳能和二氧化碳直接转化为生物燃料和生物基化学品的全新生物合成模式被称为光合生物制造技术。

然而，经典的模式藻株尽管有着较强的代谢可塑性，其生理和代谢功能上却存在诸多缺陷，如细胞生长速度较慢、光合固碳效率较低、环境适应能力较差等，基于模式藻株开发的光合细胞工厂，其产品合成能力难以达到“克／升”的产量水平，远低于常规异养微生物细胞工厂的效能，其生理功能也很难满足规模化培养、工程化应用的需要［7⁃8］。微藻平台光合生物制造技术要逐步走向工程化、规模化、产业化的推广和应用，其技术核心是开发生长速度快、合成效率高、逆境耐受能力强的高效能光合细胞工厂以及与之适配的过程工程技术体系，而技术取得突破的基础和关键则是优质微藻底盘细胞的开发［9］。以具有应用潜力的微藻藻株为平台，系统应用合成生物技术开发“可编辑、可控制、可放大”的新型微藻底盘细胞（图1），对微藻特质性光合生理和代谢功能进行深入认识、重新设计和定向改造，才能实现在大规模工程化培养体系中对光驱物质能量定向转化过程的人工控制，进而推动光合生物制造技术的产业化发展。本文以此为导向，对微藻合成生物学和光合生物制造技术的进展和面临的挑战进行介绍，并展望本领域的未来发展方向。

1 微藻底盘细胞的基因组编辑和调控

图1 针对光合生物制造技术发展需要开发“可编辑、可控制、可应用”的微藻底盘细胞和光合细胞工厂Figure 1 Development of the engineering"editable，controllable and applicable"microalgae chassis cells and photosynthetic cell factories on the basis of the photosynthetic technology

天然微藻藻株无论是代谢网络还是生理功能上都无法满足未来光合生物制造技术的需求，而优质底盘细胞和工程藻株的开发需要对微藻藻株在基因组水平上进行深度、系统改造，以实现藻株表型上的定制化改造。因此，“可编辑”是决定微生物底盘细胞开发和应用的关键属性，从技术上决定着对细胞内物质流、能量流进行人工调控的可行性。微藻底盘细胞的“可编辑性”在很大程度上取决于其遗传操作工具包的完善程度和效能［9⁃10］。现阶段，微藻遗传操作工具的发展正在多个层面取得突破并逐步完善。（1）基因组精准编辑技术。近年来，CRISRP⁃CAS9 以及一系列衍生的高效基因组编辑工具在原核蓝藻和真核微藻中都得到成功应用。相比较于传统的同源双交换策略，CRISPR 技术可以在不引入抗性标签的基础上，一步实现微藻基因组上单碱基尺度的替换、插入和删减，大大提升微藻基因组编辑的效率和精确性，有效增强微藻细胞生理和代谢表型的认识精度和改造能力［11⁃13］。华盛顿大学圣路易斯分校的Pakrasi 团队，针对速生聚球藻UTEX2973 与其近源藻株PCC7942 基因组上的55 个差异SNP，使用CRISPR 技术逐一进行突变和移植，成功鉴定到与UTEX2973 速生能力相关的3 个SNP［14］。（2）大片段DNA 操作技术。微藻底盘细胞开发和应用过程中，在进行基因组缩减、复杂功能模块克隆和重构等操作时，往往需要对百kb 以上大片段DNA 进行直接删除、克隆和整合，大片段DNA 操作技术从深度上影响着微藻光合生理和代谢网络的改造能力。传统的同源双交换策略，在精度、载荷和效率上都难以满足此类操作的要求，需要以RedET、CRISRP 技术为基础，开发新型操作工具。中科院水生所的张承才团队，通过CRISPR⁃cpf1 工具的优化和应用，成功实现了鱼腥藻PCC7120 中长达118 kb 的大片段基因组DNA 的直接删除［15］。（3）基因表达多维调控技术。在微藻代谢网络重塑过程中，往往需要同时对多个靶标基因的表达进行调控，而此类工程策略的实现需要应用CRISPRi、sRNA 等反式作用工具。Yao等［16］首次在重要的模式蓝藻藻株集胞藻PCC6803 中建立CRISPRi 技术，实现了对4 个醛还原酶和脱氢酶的同时敲低；天津大学张卫文团队则实现了集胞藻PCC6803 中sRNA 工具的成功应用，对集胞藻PCC6803 中丙二酰辅酶A 的多个竞争途径同时弱化，成功将胞内丙二酰辅酶A 的含量提高了41%，为后续细胞工厂的开发奠定了良好的基础［17］。微藻细胞具有染色体拷贝数高、膜结构发达、生长周期长等遗传、细胞和生理特征，在大肠杆菌、酵母等经典模式体系中发展起来的基因组编辑和调控工具，面临着与微藻代谢和生理网络适配性、兼容性差的风险。因此，针对微藻遗传和代谢特性，开发适配、系统、高效的遗传操作工具包将是微藻底盘细胞开发和光合生物制造技术发展的重要技术支撑。

2 微藻代谢网络的优化重塑与定向扩展

“可控制”指的是对微藻胞内光合碳流、能量流的控制能力，具体体现在基于微藻底盘细胞进行高效能光合细胞工厂的开发，实现微藻细胞内光合碳流和能量流向目标产品的高效、定向转化。光合固碳是微藻生理和代谢活性的功能基础，也是光合生物制造技术的原初动力。天然微藻细胞的光合固碳效率较低，经过卡尔文循环固定并输入的碳流难以支撑高效生物合成的需要；同时，天然微藻细胞代谢网络中能够合成的代谢产物种类有限，且产量较低，同样无法满足实质性生产的要求。开发高效能的微藻光合细胞工厂，需要针对微藻底盘细胞的代谢网络进行优化重塑和定向扩展，一方面提升光合固碳系统的效率，驱动单位时间内微藻细胞固定更多的碳支撑下游生物合成，另一方面扩展光合代谢网络，赋予微藻细胞更多、更强的催化反应，将更多的碳和能量导向目标产物的合成［8］。首先，天然微藻细胞为适应自然界节律性变化的光照和碳源条件，在长期进化过程中形成的光合系统和固碳机制，并不能适配于光合生物制造技术中持续、稳定、强化的光照和补碳体系。针对高光适应和利用的需要，加州大学伯克利分校的Melis 团队通过敲除集胞藻PCC6803 的别藻蓝蛋白，有效地提升了藻株在高光强条件下的生物量积累能力［18］。针对微藻固碳系统，已经证实通过卡尔文循环关键固碳蛋白的强化表达［19］、无机碳转运系统强化和修饰［20］、新型固碳途径的导入和调控［21］、碳损失的重吸收利用［22］等策略的开发和应用，可以有效提升微藻的光合固碳效率，进而为代谢产物合成提供更强的碳源供给和驱动力。瑞典乌普萨拉大学的Lindblad 团队在集胞藻PCC6803 中，通过过量表达RuBisco、SBPase、FBA 以及TK 等4 个关键节点蛋白，有效提升了聚球藻的光合放氧速率、细胞生长速度以及生物量积累速率［19］，而在工程藻株中使用该策略，则成功将乙醇产量提升了近70%［23］，充分证明从源头上优化光合固碳效能对开发优质光合细胞工厂的重要意义和巨大潜力。此外，微藻细胞以光合固碳过程为其生理和代谢的功能基础，在光合生长、代谢和生物合成过程中存在光吸收、电子传递、光合磷酸化与碳同化等不同过程的耦合、碳汇机制与中心代谢的互作以及天然碳汇模块和人工碳汇途径之间的适配等复杂关系，为了实现微藻胞内碳流的有效重定向，需要根据微藻自身生理和代谢特点，进行有针对性的设计。区别于经典的异养模式微生物，微藻细胞因为放氧型光合作用的存在，其胞内还原力以NADPH 而非NADH 为主要形式，本研究团队在进行蓝藻乙醇光合细胞工厂开发过程中，通过将乙醇脱氢酶从NADH 偏好性替换成NADPH 偏好性后成功提高了工程藻株50%的乙醇合成效率［24］。上述研究工作充分表明结合微藻特质性生理和代谢背景进行途径和功能模块设计的重要性。

3 微藻光合细胞工厂工业应用属性的优化

“可应用”指的是基于合成生物技术开发的微藻光合细胞工厂适应大规模培养过程中严苛工业环境条件和复杂过程工艺环节，进行稳定生长生产和有效产品回收的能力。基于整体成本和效益比的考虑，理想中的规模化光合生物制造应该能够在户外、开放式环境下进行，以自然光、经过简单处理的海水甚至工业污水和工业废气为主要原料，培养得到的生物质和目标产品的采收和提取也应该尽可能地便捷、快速以及低成本化。而实际情况是在实验室条件下开发的微藻光合细胞工厂面临工业过程环境中严苛的温度、光照、酸碱、盐度以及生物污染等各种胁迫挑战，往往无法维持细胞稳定生长和产物稳定积累；微藻生物质采收和目标产品提取都极为耗能且工序复杂，占据了整个技术链条成本的90%以上。在此背景下，应该着重从两方面优化微藻底盘细胞和工程藻株的工业属性：一是提升藻株的适切性和鲁棒性，保证光合细胞工厂在动态、复杂、严苛的工业环境下能够稳定的保持生长和代谢能力；二是提升藻株与工业过程和技术体系的适配性，即通过藻株本身生理和代谢特性的编辑使之更符合工业体系的需求，降低对藻株大规模培养的工程难度。应用合成生物技术提升藻株适切性和鲁棒性的一个成功 例 子 是，Waditee 等［25］在 淡 水 依 赖 型 聚 球 藻PCC7942 中，过量表达来自耐盐藻株Aphanothece halo⁃phytica 的Na+／H+逆向转运蛋白NhaP，成功获得可以耐受0.5 mol/L NaCl的工程藻株，在此基础上结合大肠杆菌过氧化氢酶KatE 的表达，成功提高了PCC7942 在海水中生长的能力，极大地提升了该藻株的工业应用潜力。除了微藻细胞鲁棒性和适切性的提升之外，其与工业过程体系适配性的优化对提升技术链条整体经济竞争性也有重要意义，一个典型例子就是利用合成生物技术改变细胞形态，降低生物质采收成本。目前广泛应用于光合细胞工厂开发的蓝藻模式藻株大都是单细胞藻，与丝状藻相比，其采收难度大、成本高。密歇根大学的Ducat 团队针对聚球藻PCC7942 中对形态有重要影响的Min 系统，对不同功能组分进行表达丰度调控，成功地使细胞长度由3～5 μm 延长至毫米级别，且加长的细胞在常规重力条件下表现出了更好的沉降特性，非常有利于细胞采收［26］。随着对微藻生理活动和代谢机制的深入认识，以及各种高效、精确基因组编辑手段的发展完善，新一代具有良好工业应用特性的微藻光合细胞工厂将能够成功“定制”，并极大地促进光合生物制造技术的规模化应用［7］。

4 展望和结语

在自然界中，微藻光合作用为地球生命过程提供了至关重要的初级生产力，而在更广阔时间尺度上则为地球环境从无氧到有氧的变化作出了决定性贡献。合成生物技术的蓬勃发展推动了从微藻天然藻株到微藻底盘细胞再到微藻光合细胞工厂的功能实现，可以驱动微藻单细胞层面代谢流和能量流根据人工设计的精准调控，最终实现单一平台、单一过程中光能和二氧化碳向各种生物燃料和生物基化学品的定向转化。未来，通过融合系统生物技术、过程工程、装备工程乃至人工智能技术，还将进一步实现微藻光合细胞工厂的合成能力在大时空尺度下的稳定保持，从而驱动光合生物制造技术在工业环境下的成功应用。