载他克莫司可注射温敏水凝胶促牙髓干细胞成骨向分化作用研究

王芃 何华春 李道伟 孙宏晨 吴立鹏

人牙髓干细胞(human pulp stem cells，hDPSCs)是组织再生医学领域研究的热点之一[1]。hDPSCs的获取方便，可以由患者自身牙齿的自体细胞提供。hDPSCs是干细胞，能够多向分化为成牙本质细胞，神经源性细胞，脂肪细胞细胞等[2]。由于它们有向成骨分化的能力[3]，可作为骨组织工程中细胞的选择。

他克莫司FK506是一种强效的免疫抑制剂，广泛用于实验和临床中的预防移植后的器官排斥和治疗自身免疫性疾病[4]。有研究报道，FK506的治疗可能会增加骨量，并可能对骨缺损是一种潜在的治疗方式[5]。

本研究提出一种由可注射温敏水凝胶与FK506复合材料(FK506-TH)制备的生物相容性骨修复材料。单纯应用FK506存在半衰期短、价格昂贵、易降解等问题，因此，常需与合适的药物控释系统复合，以保证其在损伤处持续高效释放，更好的发挥促进组织再生的作用。而载有促进组织修复药物的水凝胶材料在达到适宜温度时凝结成胶状固体，更具有药物缓释性能。在保证FK506药物正常发挥功能的同时，增加了可溶性温敏水凝胶的协同促进作用，以期获得具有较大性能空间的材料。长期、持续、少量的给药形式，有望在个性化医疗中得到应用。本文旨在探讨载FK506可注射温敏水凝胶(FK506-TH)作为一种有效的骨修复材料是一种有前景的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备

FK506、ALP试剂盒、茜素红S(Sigma公司，美国)；胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美国)；青霉素链霉素双抗溶液(PAA公司，美国)；Cell Counting Kit-8(DOJINDO Laboratories公司，日本)；引物(Takara公司，日本)；酶标检测仪(Bio-TEK公司，美国)；PCR扩增仪(Thermo公司，美国)。

1.2 FK506-TH水凝胶的制备

FK506储存液的制备：使用电子天平在称量纸上称取5 mg FK506粉末，放置于超净工作台内，紫外灯光照射6 h灭菌处理，将粉末溶于1.22 mL DMSO溶剂中，配置成浓度为5 mmol/L的FK506储存液，放于-20 ℃备用。

56%β-甘油磷酸钠溶液的制备：在称量纸上称取4.48 g β-甘油磷酸钠粉末，放置于超净工作台内，紫外灯光照射6 h灭菌处理，将粉末溶于8 mL H-DMEM培养基(含10%FBS、1%青霉素、1%链霉素)，0.22 μm滤器过滤，放于4 ℃备用。

2%壳聚糖盐酸溶液的制备：在称量纸上称取0.8 g CS粉末，放置于超净工作台内，紫外灯光照射6 h灭菌处理，将粉末溶于40 mL H-DMEM培养基中，磁力搅拌至颗粒完全溶解，浓盐酸调节pH至7.0， 0.22 μm滤器过滤，现配现用。

0.5%明胶溶液的制备：在称量纸上称取0.05 g明胶粉末，放置于超净工作台内，紫外灯光照射6 h灭菌处理，将粉末溶于10 mL H-DMEM培养基中， 0.22 μm滤器过滤，放于4 ℃备用。

将8 mL β-甘油磷酸钠溶液逐滴地加入到40 mL 2%壳聚糖盐酸溶液中，产生絮状沉淀，再加入1 mL明胶，配置成FK506-TH， 0.22 μm滤器过滤为可注射温敏水凝胶浸提液。使用过程中，用可注射温敏水凝胶浸提液将5 mmol/L的FK506稀释至10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 nmol/mL。

1.3 hDPSCs的分离提取及培养方法

收集2018 年12 月～2019 年1 月吉林大学口腔医院18～30 岁志愿者因埋伏阻生而拔除的无病变第三磨牙，酶消化法培养hPDSCs，取生长状态良好的第三代hDPSCs以1×105个/孔的密度接种在6 孔板中(2 mL/孔)，设置实验分组为空白对照组、可注射温敏水凝胶组、FK506组、载FK506可注射温敏水凝胶组。

1.4 FK506-TH的细胞毒性实验

CCK-8实验测定FK506-TH浸提液浓度为0、 10、 50、 100、 500、 1 000、 1 500、 2 000 nmol/L对hPDSCs增殖的影响， 平行实验重复3 次。

1.5 FK506-TH促进成骨分化实验

成骨诱导液的制备：可注射温敏水凝胶浸提液(含10%胎牛血清、50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10-8mol/L地塞米松)。

按照上述1.3方法接种细胞，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。贴壁后换为成骨诱导液，分别诱导3、7、14 d， 每3 d换液，未处理的细胞为阴性对照。采用Real-time PCR检测ALP、COLI1、Runx2、OCN和OPN表达水平。

1.6 茜素红染色

按照上述1.3方法接种细胞，在37 ℃、 5% CO2培养箱中孵育。贴壁后换为成骨诱导液，继续培养21 d，每3 d换液。

染色方法：染色前去除原培养液，PBS冲洗3 次，用3 mL预冷的95%乙醇溶液在4 ℃条件下固定1 h，三蒸水冲洗3 次，加入茜素红S染液3 mL放于4 ℃持续染色30 min，PBS洗净浮色，观察并拍照。

茜素红染色定量：每孔加入1 mL 10%氯化十六烷基吡啶(10 mmol/L PBS配置，pH为7.0)，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育30 min，吹打混匀后加入96 孔板内，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，记录结果，计算所有复孔的平均值，平行实验重复3 次。

1.7 碱性磷酸酶染色

按照上述1.3方法接种细胞，在37 ℃、 5%CO2培养箱中孵育。贴壁后换为成骨诱导液，继续培养7 d，每3 d换液。

染色方法：ALP固定液(柠檬酸-丙酮-甲醛固定液)预热至26 ℃，固定细胞30 s，去离子水轻轻冲洗45 s， 37 ℃ ALP染色液避光染色15 min，去除染液，去离子水冲洗2 min，苏木精染液复染2 min，自来水洗净浮色，观察并拍照。

ALP染色定量：培养7 d后，酶消化法收集细胞，裂解细胞，收集上清液并与碱性磷酸酶测定混合，使用酶标仪在405 nm处测定吸光度，记录结果，计算所有复孔的平均值，平行实验重复3 次。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 FK506-TH适宜浓度的选择

单纯水凝胶(0 nmol/L)能明显促进hDPSCs增殖(P<0.001)，浓度(10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 nmol/L)的载FK506可注射温敏水凝胶浸提液均可促进细胞增殖(P<0.05)。当浓度为500 nmol/L时促进细胞增殖的作用更明显(P<0.01)(图 1)。因此，选择500 nmol/L浓度的载FK506可注射温敏水凝胶浸提液用于后续检测促成骨分化能力的实验。

图 1 FK506-TH浸提液对 hDPSCs增殖的影响(*: P<0.5,**: P<0.1, ***: P<0.01)

2.2 FK506-TH对成骨相关基因表达的影响

图 2显示，在hDPSCs培养体系中成骨诱导3 d后，与空白对照组相比，单纯FK506组和FK506-TH组成骨相关基因ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表达均上调(P<0.05)，FK506-TH组Runx2、OPN的表达上调更明显(P<0.01)。相对于单纯FK506组，FK506-TH组ALP、COLI1、Runx2的表达明显上调(P<0.01)，OCN、OPN的表达上调不明显(P<0.05)。加入药物7 d后，与空白对照组相比，单纯FK506组和FK506-TH组ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表达均上调(P<0.01)，FK506-TH组ALP、COLI1、OCN的表达上调更明显(P<0.001)。FK506-TH组ALP、COLI1、OCN和OPN的表达均高于单纯FK506组(P<0.05)，其中Runx2的表达明显上调(P<0.01)。加入药物14 d后，与空白对照组相比，单纯FK506组和FK506-TH组ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表达均上调(P<0.01)，FK506-TH组ALP的表达上调更明显(P<0.001)。FK506-TH组相对于单纯FK506组，ALP的表达上调不明显(P<0.05)，而COLI1、Runx2、OCN、OPN的表达显著提高(P<0.001)。

2.3 茜素红染色和定量

成骨诱导21 d，茜素红染色显示，空白对照组与单纯水凝胶组、FK506组、FK506-TH组3 组，均可见鲜红色钙化结节，且与空白对照组相比，其余3 组形成的钙结节明显多于空白对照组，其中FK506-TH组钙化结节形成更多(P<0.001)(图 3～4)。

2.4 碱性磷酸酶染色和定量

诱导7 d后，ALP染色显示，空白对照组与单纯水凝胶组、FK506组、FK506-TH组3 组，均可见细胞核呈蓝色，且与空白对照组相比，其余3 组较空白对照组染色细胞多，其中FK506-TH处理的细胞中，更多的ALP细胞簇呈阳性(P<0.001)。

图 3 FK506-TH浸提液对hDPSCs矿化能力的影响

图 4 FK506-TH浸提液对hDPSCs ALP活性的影响

3 讨 论

FK506是钙调神经磷酸酶抑制剂，钙调神经磷酸酶是一种参与NFAT活化的酶。NFATc1是神经钙蛋白的下游底物，在T细胞活化时表达强烈[6]。NFATc1又是破骨细胞生成所必需的[7]。破骨细胞是多核的、骨吸收细胞，在骨重建和钙稳态调节中是必不可少的[8]。已有学者提出，FK506可以通过体外靶向钙调神经磷酸酶-NFAT途径抑制破骨细胞形成[9]。研究结果的复杂性表明，对破骨细胞的抑制作用只是药物对骨影响的一个部分，成骨细胞也表达钙调神经磷酸酶。有研究报道，钙调神经磷酸酶在调节成骨细胞的起源和功能中发挥作用[10]。FK506可以促进成骨细胞的转录因子的表达，包括Runx2、OPN和OCN[11]。水凝胶具有一定的力学性能，非常适合药物和细胞的局部植入[12]，也能形成三维水凝胶结构与适应的网格大小，以促进药物传递和细胞移植[13]。

为了明确FK506-TH对体外成骨细胞分化及成熟的作用，本研究通过酶解法提取hDPSCs，并分别在可注射温敏水凝胶、FK506、FK506-TH 3 种条件下探究不同药物对hDPSCs的影响。首先，细胞毒性实验表明，支架材料可注射温敏水凝胶及FK506-TH(0～2 000 nmol/L浓度)无细胞毒性，在体外易于hDPSCs的附着和增殖，具有良好的生物相容性，二者的协同促进作用使他们成为再生医学领域的理想材料。RT-PCR显示成骨诱导3 d时，FK506-TH作用后，ALP表达水平上调显著，ALP是成骨分化早期的基因，表明成骨细胞活性高。COLI1和Runx2骨形成标志物的显著增加可以表明培养基中含有较高的骨基质。成骨诱导7 d时，Runx2得表达显著增加，说明hDPSCs有较高的成骨活性，Runx2是成骨分化过程中的关键基因，在成骨分化的各个时期均发挥重要的调控作用。14 d时，ALP的表达上调不明显，可能受多种因子的影响，在本实验中不能明确FK506-TH对ALP的作用。而COLI1、Runx2、OCN、OPN的表达显著提高，OCN和OPN的含量高代表已形成了成熟骨基质。综合以上RT-PCR结果分析，FK506-TH在成骨分化各期均可明显促进成骨相关基因的表达，因而证实FK506-TH可以发挥一定的促成骨作用，并且相对于单纯FK506药物，其促成骨作用更强。为了进一步验证RT-PCR的结论，本实验同时进行了茜素红钙结节染色和碱性磷酸酶活性检测。二者的结果均证实：可注射温敏水凝胶、FK506、FK506-TH均可促进hDPSCs分化和矿化，且FK506-TH显示出更强的促成骨分化能力。其临床应用价值有待体内实验进一步研究。