甲状旁腺素相关蛋白核定位序列及C-末端缺失对幼年小鼠下颌切牙发育影响及机制研究

刘洪 颜成东 蒋尚飞

甲状旁腺素相关蛋白(parathyroid hormone related protein, PTHrP)已经被证实分布于人体的多种器官和组织，如牙齿、骨骼、皮肤等[1]。其N末端的氨基酸序列和甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)高度同源，并且共享PTH/PTHrP 1型受体(PTH/PTHrP type 1 receptor)，发挥类似的生理学功能；而其核定位序列和C-末端能够进入胞核，发挥调节细胞周期功能[2]。利用基因工程手段制作仅表达PTHrP蛋白N末端1-84位氨基酸的动物模型PTHrP knock in(PTHrP KI)小鼠[3]，并且和野生型(wild type, WT)小鼠相比，结果发现PTHrP KI小鼠的下颌磨牙发育明显不良，Hertwig上皮根鞘(herswig's epithelial root，HERs)细胞增殖减少，显示细胞凋亡的指标如p27明显上调[4]。活性氧(reactive oxygen species, ROS)由线粒体在进行呼吸作用时产生，是有氧代谢的副产物，包括超氧阴离子自由基(O2-·)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH·)和单线态氧等[5]。研究表明，ROS能直接损伤DNA导致细胞凋亡，而体内多余的ROS能够被超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1，SOD1)、超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2，SOD2)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)等酶抗氧化系统所清除[6-8]。本次研究使用2 周龄PTHrP KI小鼠并与同窝的WT小鼠比较下颌切牙的发育、矿化和凋亡情况，并检测相关酶抗氧化系统的RNA表达水平。

1 材料与方法

1.1 试验动物

将成年雌雄PTHrP KI杂合子小鼠(小鼠购自江苏省实验动物中心)合笼，子代小鼠出生后立即剪尾尖提取DNA，使用PCR扩增目标片段并使用BstEⅡ内切酶进行酶切PCR产物，电泳后鉴定基因型[9]，获得同窝的野生型(wild type, WT)小鼠和PTHrP KI仔鼠，为了控制实验的均一性，控制每窝WT小鼠和PTHrP小鼠均为2 只。小鼠生长至2 周龄使用颈椎脱臼法处死、取材，WT小鼠和PTHrP KI小鼠分别取20 只进行X线检查、切片染色和real-time RT-PCR检测。本次实验经过江苏医药职业学院伦理委员会审核通过。

1.2 取材

待WT小鼠和PTHrP KI小鼠生长至2周后，颈椎脱臼处死，解剖分离左右两侧下颌骨，左侧下颌骨解剖分离下颌切牙后置于液氮中保存进行后续的real-time RT-PCR检测，右侧下颌骨使用免疫电镜固定液进行固定后先进行X线扫描，然后使用乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙30 d，待脱钙完成后沿着下颌第二磨牙的远中将下颌骨切断，分别脱水包埋，下颌骨前部沿着下颌第一磨牙的近中根管方向进行切片，片厚5 μm，用来进行HE染色、总胶原染色和免疫组织化学染色；后部沿着近远中方向进行切片，片厚5 μm，用来进行原位末端转移酶标记检测(TUNEL)染色。

1.3 X线扫描

将用免疫电镜固定液固定后的小鼠下颌骨使用805型X光机(Faxitron公司生产,德国)进行X线扫描，并且分别测量X光片上的小鼠下颌切牙的长度和切缘厚度。

1.4 HE染色

石蜡切片使用先使用二甲苯进行脱蜡，然后从高浓度到低浓度的梯度酒精当中进行水化，使用苏木素进行染色5 min，流水冲洗至细胞核呈现蓝色，使用伊红染色30 s，再使用从低浓度到高浓度直至无水酒精进行脱水，二甲苯透明3 次，中性树胶封片。

1.5 总胶原染色

石蜡切片顺序使用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后使用苦味酸-直红染色液热色30 min，流水冲洗后苏木素染色30 s，再次流水冲洗后梯度酒精脱水，二甲苯透明后使用中性树胶封片。

1.6 I型胶原免疫组化染色

石蜡切片循序二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后使用0.5%牛睾丸透明质酸酶消化30 min后流水冲洗，用5%正常兔血清封闭20 min，分别加入鼠源I型胶原单克隆一抗(1 ∶500，Merk公司, 美国)4 ℃孵育过夜，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，加兔抗鼠IgG二抗(1 ∶200，Sigma公司, 美国)，室温孵育30 min；PBS清洗，加使用生物素-亲和素-桥联碱性磷酸酶酶标液(ABC-AP， Vector公司, 美国)孵育，PBS清洗，碱性磷酸酶染色液染色，甲基绿复染，加热明胶并过滤后使用过滤后的明胶封片。

1.7 TUNEL染色

石蜡切片循序二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，使用0.01%蛋白酶K孵育5 min，使用PBS清洗，用TUNEL反应混合物(Boehringer Mannheim公司， 英国)在37 ℃下孵育60 min，再次使用PBS清洗，converter-AP(Vector公司， 美国)孵育30 min后继续使用PBS清洗，碱性磷酸酶显色液染色，甲基绿复染，加热明胶并过滤后使用过滤后的明胶封片。

1.8 实时荧光定量RT-PCR实验

从液氮中取出小鼠下颌切牙，在研钵中捣碎，一步法提取总 RNA，常规方法进行逆转录，使用real timeRT-PCR方法检测骨钙素(osteocalcin, OCN)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA表达水平。用7300 System SDS software 软件(Applied Systems 公司，美国)统计分析实验结果，PTHrP KI组各个指标以WT组作为参照。

1.9 统计学方法

实验数据输入SPSS 10.0统计学软件进行组间单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 X线扫描结果

X线扫描结果显示，PTHrP KI组小鼠的下颌切牙长度为(6.34±0.31) mm，切缘厚度为(0.34±0.02) mm，而WT组小鼠下颌切牙长度为(8.83±0.34) mm，切缘长度为(0.47±0.03) mm，PTHrP KI组小鼠下颌切牙长度、切缘厚度均明显低于WT组小鼠(P<0.05)(图 1，表 1)。

2.2 HE染色、总胶原染色、I型胶原免疫组化染色和TUNEL染色结果

通过HE染色检测前期牙本质和牙本质，并且计算前期牙本质占总牙本质的比例，WT小鼠的前期牙本质占总牙本质比例明显高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)；使用总胶原染色方法测定根管厚度， WT小鼠的髓腔壁牙本质厚度明显高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)；I型胶原免疫组化染色表明WT小鼠的I型胶原阳性面积占切牙面积的百分比明显高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)；TUNEL染色结果显示WT小鼠的切牙末端凋亡细胞比例明显低于PTHrP KI小鼠(P<0.01)(图 2、 表 2)。

图 1 2 组小鼠X线扫描

表 1 小鼠下颌切牙长度和切缘厚度 (n=20,

图 2 2 种小鼠下颌骨及牙齿染色方法检测 (A～F:×400, G、 H: ×200)

表 2 HE染色、总胶原染色、I型胶原免疫组化染色和TUNEL染色结果统计

表 3 实时荧光定量RT-PCR实验结果

2.3 实时荧光定量RT-PCR实验结果

实时荧光定量RT-PCR实验结果显示，WT小鼠的ALP、OCN、SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA表达水平均高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)(表 3)。

3 讨 论

PTHrP最初被发现在癌症恶液质患者中，这些患者均伴有明显的消瘦和高钙血症[10]。进一步的研究发现，PTHrP在血液中的浓度极低，在机体发育的不同时期、不同组织中均有表达，PTHrP的不同片段具有不同的生理功能， 其N-末端1-84位氨基酸序列与PTH相同，使用共同的受体，也发挥调节钙、磷水平的作用，核定位序列(87-107位氨基酸)能进入细胞核起到胞内分泌的作用， C-末端有抑制骨吸收作用[11]。利用基因工程技术制作仅表达PTHrP蛋白N-末端1-84位氨基酸的小鼠动物模型，发现小鼠生存期极短，仅为15～18 d，尽管该种动物模型的血清钙、磷浓度基本正常，但是小鼠的多种器官均发育不良[12]。

本次实验利用2 周龄PTHrP KI小鼠进行实验，并且和同窝的WT小鼠进行对照。X光扫描表明，PTHrP KI小鼠下颌切牙的长度明显缩短，并且切缘的厚度也明显减少，X光检查的实验初步表明PTHrP核定位序列和C-末端的缺失可能导致了小鼠下颌切牙的发育障碍；进一步进行HE染色检查，结果发现，PTHrP KI小鼠下颌切牙的前期牙本质所占的比例明显增加。此外，实时荧光定量RT-PCR实验结果发现，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失导致了小鼠下颌切牙ALP和OCN的mRNA表达水平明显下调。研究表明，在牙本质的形成过程当中，成牙本质细胞不断地合成和分泌有机基质，然后矿物不断地在有机基质当中沉积形成牙本质，而前期牙本质是在成牙本质细胞和牙本质之间的一层没有矿化的有机基质，ALP矿化过程中能够发挥促进钙离子与磷酸盐结合形成无机物结晶的作用，在牙本质的钙化开始后，成牙本质细胞中的ALP表达水平明显增高；而OCN是一种牙本质非胶原蛋白，主要由成牙本质细胞合成和分泌，在牙本质的矿化过程中起到重要的作用[13]。本研究结果表明，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失导致了小鼠下颌切牙前期牙本质比例增加，牙本质矿化不良。

总胶原的染色结果发现PTHrP KI小鼠下颌切牙髓腔壁的厚度明显减少，进一步的I型胶原免疫组化染色表明，PTHrP KI小鼠的I型胶原阳性面积也明显减少。牙本质的胞外基质中主要成分是胶原蛋白，在胶原蛋白中，尤以I型胶原为主；另外还有少量的蛋白多糖和糖蛋白；这些胶原蛋白按照特定的空间构象进行排列，构成了牙本质的主要框架结构，矿物质沉积于其间[14]。上述实验结果表明，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失导致了小鼠下颌切牙的胞外基质分泌减少。

此外，TUNEL染色表明，PTHrP KI小鼠下颌切牙颈环及附近牙髓细胞凋亡明显增加。小鼠的下颌切牙终身生长，其原因在于小鼠的下颌切牙末端上皮结构不能像磨牙一样形成HERs结构而是被称为颈环，因而不能形成真正意义上的牙根而终止牙齿的发育[15]。进一步对SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px等酶抗氧化mRNA的表达水平检查也发现，PTHrP KI小鼠下颌切牙的SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA的表达水平明显降低。 线粒体在进行呼吸作用时，可以产生 ROS，过多的ROS如果不能被及时的清除，不仅能够直接攻击DNA导致细胞凋亡，也可以通过Fas通路、P53/MPTP 通路、NF- B通路等信号通路引发细胞凋亡；正常情况下，酶抗氧化系统能够及时的清除ROS，使得ROS 维持在低水平[16-17]。本研究结果却发现，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失导致了小鼠下颌切牙的SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA的表达水平明显降低，表明线粒体呼吸作用产生的ROS不能被及时清除，导致相关区域的氧化应激异常，进而使得细胞凋亡增加，从而导致小鼠下颌切牙变短，发育异常。

本研究结果表明，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失导致幼年小鼠下颌切牙颈环细胞凋亡增加、牙本质的胞外基质生成和矿化减少，导致了小鼠下颌切牙的发育异常。