SARS-CoV-2核酸检测技术进展及应用

黄 斐， 张春燕， 潘柏申， 王蓓丽， 郭 玮

（1.复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032；2.复旦大学附属中山医院厦门医院检验科，福建 厦门 361015）

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）可引起新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），目前SARS-CoV-2核酸检测是确诊COVID-19和无症状感染的有效手段。临床主要针对SARS-CoV-2的抗体和核酸进行检测。SARS-CoV-2抗体检测操作简便、检测快速，但抗体具有一定的窗口期，仅可作为核酸检测的补充手段。核酸检测作为诊断病原体感染的“金标准”，具有早期诊断以及灵敏度和特异性高等特点，适用于无症状感染者的早期筛查以及患者疾病的管控。

近年来，病毒核酸检测技术发展迅猛，除临床常用的实时荧光逆转录（reverse transcription，RT）聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术外，基于高通量测序（next generation sequencing，NGS）技术、基于等温扩增技术、基于杂交捕获免疫荧光技术和基于基因芯片技术检测SARS-CoV-2的方法也处于研发当中，部分技术已应用于临床。为扩大重点地区筛查范围，加强疫情防控力度，寻求一种高效的核酸检测途径势在必行。混样检测可大幅提升检测效率，缓解检测压力，节省医疗资源，但其如何规范、科学地应用于临床实践，需要更多研究结果的积累和总结。本文对SARS-CoV-2核酸检测技术和混样检测模式进行综述，以期为临床实验室选择适宜的检测技术和大规模人群的筛查策略提供参考。

1 基于NGS技术的核酸检测

《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[1]明确了病原学检查应采用NGS技术检测上/下呼吸道、血液、粪便等样本中的SARSCoV-2核酸。NGS是对样本中的病毒核酸进行大规模平行测序，通过生物信息分析病毒全序列或特定序列[2]，检测流程包括构建文库、测序和生物信息分析。基于NGS的核酸检测包括宏基因组测序、探针捕获测序和多重PCR扩增子测序，表1为不同NGS技术的原理、特征和适用场景[3]。宏基因组测序受样本中病毒载量的影响，测序数据量不足会导致病毒序列信息获取不完整，影响后续分析。多重PCR建库能富集极低载量（载量＜102拷贝/mL或Ct值＞35）的病毒核酸。基于Tn5转座酶的转录组测序法优化了建库过程，对样本量需求较小，提高了SARS-CoV-2测序的质量和速度[4]。

表1 不同NGS技术的特征

NGS技术在SARS-CoV-2的鉴定中发挥了重要作用。疫情初期，借助NGS技术，仅用5 d就获得了病毒全基因组序列并确认了病原体[5]，而2003年严重急性呼吸综合征冠状病毒和2013年人禽流感病毒的发现均耗时数月，NGS作为可快速确定病原体的关键技术，为后续设计其他检测试剂盒提供了相关基因序列信息。研究人员通过NGS技术发现5例湖北武汉金银潭医院重症肺炎患者的支气管肺泡灌洗样本中存在相似度99.9%的共同序列，且与严重急性呼吸综合征冠状病毒有79.5%的序列一致[6]。病毒全基因组序列的组装在溯源进化分析、预测病毒的传播模式、发现和分析突变位点等方面亦有重要的作用。多个研究机构的测序结果显示，SARS-CoV-2与蝙蝠相关冠状病毒ZC45和ZXC21的同源性约为88%[7]，为揭示病原体传播途径、追溯传染源头提供了依据。NGS技术也有助于混合感染的鉴别，已有团队研发出纳米孔靶向测序技术，此技术能同时检测包括SARS-CoV-2在内的40种常见呼吸道病毒[8]。尽管NGS技术有上述优势，但检测周期长、流程复杂、未标准化、缺乏专业生物信息分析人员、测序深度不足（综合成本和时间）等不足，使其难以成为临床一线普遍开展的方法。

2 基于实时荧光RT-PCR技术的核酸检测

实时荧光RT-PCR技术是目前临床上广泛应用的SARS-CoV-2核酸检测方法，具有检测时间短、操作便捷、特异性及重复性好的特点。实时荧光RT-PCR技术首先将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增，利用荧光标记的特异性探针对反应产物进行标记跟踪，实时监测产物扩增量，根据扩增曲线计算出起始模板量[9]。

目前获批的SARS-CoV-2检测试剂盒主要针对ORF1ab、N和E基因保守基因序列，根据针对靶标数量可分为单靶标、双靶标和三靶标检测试剂。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[1]推荐选用至少包含针对ORF1ab、N基因区域的检测试剂。我国共有80多家企业进行SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的研发，目前已有10余个基于实时荧光RT-PCR技术的检测试剂盒获得国家药品监督管理局的审批。获批的试剂盒主要采用2种不同的内标方式对检测体系进行监控，包括人源性内标（内源性）和合成假病毒内标（外源性）。相比外源性内标，内源性内标能对整个步骤进行监控，包括采样（检测前）、实时荧光RT-PCR检测（检测中）。全国SARS-CoV-2核酸检测室间质量评价以及多项研究结果显示，不同试剂的检测灵敏度不同（200～1 000 拷贝/mL），针对的靶标也不同，同时各检测试剂对弱阳性样本的结果存在一定的差异，因此应尽可能采用不同检测试剂对弱阳性样本进行复检，以保证结果的准确性[10]。紧急获批的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒研发上市时间短，质量良莠不齐，因此各实验室应在临床应用前完成性能验证，实验人员应在检测过程中做好质量控制，对可疑结果应及时与临床沟通。

3 基于等温扩增技术的核酸检测

实时荧光RT-PCR技术灵敏度高、特异性好，是SARS-CoV-2核酸检测的“金标准”，但仍存在局限性，昂贵的检测设备和对检测人员的专业要求限制了这一技术在各级医院，尤其是基层医院检验科的开展，且检测耗时（2 h）无法满足庞大的检测需求，因此亟待开发更快速、简便、高灵敏度的检测方法[11]。基于等温扩增的核酸检测技术在SARS-CoV-2检测中显示出了良好的应用前景。

3.1 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术

2000年，NOTOMI等[12]建立了一种快速、便捷、高灵敏度的新型核酸检测方法，即LAMP技术。应用WarmStart RTx逆转录酶可在1个反应中同时完成RT和LAMP，无需逆转录后的纯化，显著缩短了反应时间，实现了快速SARSCoV-2核酸检测。国内外多个团队正在研发基于RT-LAMP技术的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒[13-15]，用4～6条针对SARS-CoV-2ORF1ab、S、E和N基因专门设计的引物，在等温（65 ℃）条件下利用链置换DNA聚合酶合成靶序列，整个过程不到1 h即可完成，最后通过pH指示剂的颜色变化进行可视化判读，或通过探针进行实时荧光监测[13]。有研究结果显示，RT-LAMP技术检测灵敏度与实时荧光RT-PCR技术相似，且与其他呼吸道冠状病毒无交叉反应，检测特异性高于血清学检测[14]。通过比较56例临床样本的检测结果发现，2种方法检测一致率高达92.9 %[14]。在4例检测结果不一致的样本中，有2例实时荧光RTPCR阳性但RT-LAMP阴性，这是由病毒载量较低（在实时荧光RT-PCR检测中Ct值接近38）导致的；而2例RT-LAMP阳性（阈值＞45 min），但实时荧光RT-PCR阴性，推测原因可能是存在病毒变体，导致与实时荧光RT-PCR引物和/或探针不匹配[15]。RT-LAMP与实时荧光RT-PCR比较详见表2。随着技术的优化，研究组人员已开发出免抽提的RT-LAMP检测方法用于即时检验（pointof-care testing，POCT），尽管有假阳性结果，但可用于快速筛查，对阳性样本，经实时荧光RT-PCR进行确认。

表2 RT-LAMP与RT-PCR技术的比较

3.2 切口酶扩增反应（nicking endonuclease amplification reaction，NEAR）技术

NEAR技术通过切口酶识别病毒核酸的特定短序列，被切割序列在等温（60℃）条件下合成平末端，合成的短序列被继续切割，上述过程循环往复。短序列（单链）与荧光探针结合，荧光信号达到阈值才能判断为阳性。该项技术稳定性高、检测速度快、灵敏度高，但由于反应机制复杂，产量易受模板限制，后期将从指数扩增转变为线性扩增。雅培ID NOW平台已获得美国食品与药品监督管理局的认证，可在5～13 min内获得结果，在13 min内达到阈值即可判断为阳性；超过13 min则为阴性。其检测限为几百拷贝，免核酸提取，设备简单，在任何情况下均可快速检测，但无法满足高通量的需求，且对于短序列的检测假阳性率高。有研究将该方法与实时荧光RT-PCR进行比较，使用2种方法检测524例确诊患者的鼻咽拭子，阳性和阴性一致性分别为75%和99%[16]。

3.3 核酸序列扩增（nucleic acid sequencebased amplification，NASBA）技术和滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）技术

NASBA技术是由一对引物介导的对单链RNA特异等温扩增的技术，其反应温度为42 ℃，可在2 h内对核酸实现109～1012的扩增[17]。该技术不受样本中内源和外源性物质的干扰，更适用于鼻咽拭子、血液和体液样本的直接检测[18]。RCA技术基于核酸分子滚环复制的等温扩增技术，可在90 min内实现109扩增[19]。WANG等[20]利用RCA技术实现了少量呼吸道样本中SARS-CoV-2的核酸检测。

3.4 联合等温扩增的CRISPR-Cas13技术

2017年，ABUDAYYEH等[21]证实Cas13编辑后能靶向切割多种哺乳动物体内单链RNA病毒，随后，其团队研发了一种联合等温扩增的CRISPR-Cas13检测RNA的技术，被称为特异性高灵敏度酶报告系统[22]。利用该技术，研究人员设计出2种向导RNA，分别针对SARSCoV-2的S和ORF1ab基因。若样本中存在SARSCoV-2，向导RNA可靶向识别，激活与其结合的Cas13蛋白，实现病毒RNA切割，随后根据试纸上的条带数目和位置，直观地确认SARS-CoV-2是否存在。检测流程仅需3步，整个过程不到1 h：（1）42 ℃等温扩增25 min；（2）加入Cas13蛋白，向导RNA以及报告分子，37 ℃反应30 min；（3）利用试纸检测反应后的样本，仅需2 min。该技术能稳定检出SARS-CoV-2序列，且灵敏度高，检出限为10～100拷贝/μL[23]。该方法操作便捷、仪器便携、检测周期短，适用于基层医疗单位和居家自检，具有ROCT的应用潜力。我国已有企业利用此技术研发试剂盒，但目前尚未应用于临床。由于使用的引物较多，向导RNA设计难度高，应注意特异性及“脱靶”效应导致的假阴性。

4 其他检测技术

4.1 杂交捕获免疫荧光法

杂交捕获免疫荧光法是核酸杂交和免疫荧光捕获相结合的检测技术，可快速检测病毒核酸，无需核酸提取纯化和PCR扩增。通过处理液直接裂解并释放病毒靶标核酸，靶标核酸和探针形成DNA/RNA杂交体，通过识别杂交体的荧光信号来判断结果。该技术仅需20 μL咽拭子或痰液样本，平均检测时间为45 min，1 h最多可检测60例样本。

4.2 基因芯片

基因芯片作为一种快速且高通量的检测技术，已广泛用于其他冠状病毒检测。该技术首先将病毒RNA逆转录为cDNA，并与特定探针结合，与特定探针结合的cDNA和固相芯片上的寡核苷酸杂交，经洗涤后去除游离DNA，最后通过特定检测探针完成病毒核酸检测[24]。目前，研发人员已开发出6种呼吸道病毒核酸等温扩增芯片，可在1.5 h内检测包括SARS-CoV-2在内的多种呼吸道常见病毒。随着技术的发展，基因芯片检测灵敏度与实时荧光RT-PCR技术相当，且多种病毒特异性基因序列探针的设计使其诊断准确率也有所提高。

5 混样检测模式

有研究者提出可采用混样检测进行SARSCoV-2核酸筛查，即9～10个拭子样本混合筛查的策略[25]。早在2000年，混样检测已在血库中开展，用于排除献血者感染乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒和梅毒螺旋杆体。混样池大小可通过数学模型进行预估[26]，根据给定的流行率能估算出最佳混样数量，但仅能作为研究的理论依据，无法直接应用于实践。在提升检测效率的同时，为保证检测敏感性和准确性，多个研究对不同混样检测模式进行了验证和探索，同时指出了低病毒载量样本漏检的风险[27-28]。2020年7月23日，我国国家卫生健康委办公厅印发的《新冠病毒核酸筛查稀释混样检测技术指引》[29]划定了混样检测适用范围，规定了样本混合的模式、具体步骤和注意事项，指出严禁应用“一步法”检测。2020年8月19日，我国国家卫生健康委办公厅制定了《新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范》[30]，规范了混采的模式、具体步骤和注意事项，取消了对检测试剂的方法学限制，提出“选择检测限低和灵敏性高的检测试剂盒”的要求。相比单样检测，混样检测对样本质量要求更高。在混样检测的情况下，无法通过内参基因发现单个样本采样不足的情况，可能产生错误报告，因此应对采样人员进行标准化培训，确保每例样本的质量都合格。目前，对于发热门诊有症状患者、密切接触者等高风险人群的检测，还是应该采用单采单检。对于低风险人群的筛查，则可以优先选择混样检测。

6 展望

为适应我国疫情防控需求，做到“早发现、早报告、早诊断、早隔离、早治疗”，越来越多的医疗和公共卫生机构拟开展SARSCoV-2核酸检测。检测需求激增，加之临床实验室的空间、人力、软件和硬件资源受限，使得核酸检测实验室对简便、快速、友好的检测技术更为青睐，如POCT和自动化一体机。在此基础上，微流控恒温分子诊断技术应运而生，其快捷、简便的优点可实现去中心化，有利于推进基层疫情的防控。

不同SARS-CoV-2核酸检测试剂盒具有不同的技术特征，因此在临床应用前应充分了解检测技术的优劣。临床应用时提倡采用多技术相结合的模式，取长补短，增强实用性，提高病毒的快速明确诊断和鉴别诊断的能力，发现疑似结果应及时与临床沟通。