健康正常无性生活史女性阴道分泌物中微生物组学分析

吴意，王芳，刘泽滨

女性阴道分泌物中的菌群是一个较为复杂的微生态系统。健康正常女性阴道内存在种类繁多的微生物群，它们与宿主之间构成相互协调、相互制约、相互作用的动态平衡关系，也是宿主抵御病原菌或条件致病菌的重要屏障之一，与人体健康和疾病的关系非常密切。女性阴道内的微生态平衡受到体内外微环境变化、药物作用、宿主的激素水平和机体免疫调节状态等诸多因素共同影响，一旦平衡被打破，就容易导致疾病的发生和发展。由于阴道内的菌群主要为厌氧茵，而且培养条件苛刻，使用传统细菌培养和分离鉴定技术很难全面了解阴道菌群结构，限制了对女性阴道微生物菌群结构多样性与疾病关系的进一步研究。近年来随着分子生物学诊断技术的飞速发展，人们对阴道内的微生物菌群有了突破性认识。本研究分析健康正常无性生活史女性阴道分泌物中菌群结构，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

随机选取2017年1月至2018年12月在深圳市福田区妇幼保健院妇保科作婚检的健康正常无性生活史女性29例作为研究对象，白带常规检查各项指标均正常且无任何临床妇科症状。

1.2 标本采集

阴道内侧壁上1/3处取分泌物，为防止样本污染，使用一次性原装阴道拭子严格无菌操作，采样时不能触碰到阴道外皮肤或阴道拭子管外壁，所有样本立即-20℃冰箱保存。

1.3 仪器设备及试剂

主要仪器IIIumina HiSeq 2500基因测序仪购于美国IIIumina公司，5 QL 900型漩涡振荡器购于海门的其林贝尔，417 R型低温台式离心机购于德国Eppendorf公司，Thermomixer仪器购于德国Eppendorf公司；构建文库用的ITS序列和16S rRNA基因试剂盒购于华大基因有限公司武汉分公司。

1.4 样本DNA提取

在样本采集管中加入1 mL无菌生理盐水充分震荡，将阴道分泌物洗脱并转移到1.5 mL离心管中12 000 r/min离心10 min，弃去上清液后在沉淀物中加入50 μL DNA提取液，接着放在100℃干浴器中裂解10 min，最后12 000 r/min离心5 min。上清液中样本DNA模板可保存-20℃冰箱备用。

1.5 文库构建和测序

文库构建及测序参照吴意等[1]文章中的步骤进行。

1.6 序列拼接及数据处理

序列拼接及数据处理同样参照吴意等[1]文章中的步骤进行。使用R软件和秩和检验进行个体间显著性差异分析，P值校正通过R(v3.1.1)包中的p.adjust进行，校正方法为“BH”。

1.7 统计学处理

使用R软件(v3.1.1) 和秩和检验进行个体间显著性差异分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 29份样本物种注释分析结果

样本16S rRNA基因的OTU通过与Greengene数据库比对分析，分别注释出12个门、11个纲、14个目、26个科、36个属和19个种水平物种(图1～6，见彩插1、2)。样本ITS序列的OTU通过与Greengene数据库比对分析，分别注释出1个门、1个纲、1个目、1个科、1个属和2个种水平物种，其中2个种水平物种分别为白假丝酵母和近平滑假丝酵母。

2.2 样本多样性

单个样本Alpha多样性不同指数的稀释曲线结果显示测序深度已基本覆盖到样品中所有的物种，图7为样本分析稀释曲线(见彩插2)。Alpha多样性分析中Sobs指数、Chao指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数均显示不同样本间物种多样性差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 样本间物种组成聚类分析

样本间物种组成聚类分析结果显示29份健康正常无性生活史女性阴道分泌物中菌群结构整体比较相似，差异较小，见下页图8。

2.4 样本间多样性分析

样本间Beta多样性分析结果显示29份健康正常无性生活史女性阴道分泌物菌群结构大多数比较相似，少数存在部分差异，见图9(见彩插2)。

2.5 物种热图分析

Heatmap聚类分析显示29份阴道分泌物样本在属水平物种组成及丰度比较相似，属水平3个主要物种分别为乳杆菌属、小类杆菌属和普氏菌属，见图10(见彩插2)。

注:样本越靠近,枝长越短,说明两个样本的物种组成越相似。图8 29份阴道分泌物样本聚类分析图(按Description分组,weighted_unifrac)

3 讨论

阴道内菌群结构是女性重要的微生态体系之一，健康女性阴道内存在一定数量和种类的常居菌群，主要由原核细胞型、真核细胞型和非细胞型微生物组成，与人类的健康和疾病关系密切。正常健康女性阴道内可分离出50多种微生物，G+需氧菌主要是乳酸杆菌、隐性杆菌、肠球菌、葡萄球菌以及气球菌等；G-需氧菌主要是大肠杆菌、加德纳菌、奈瑟氏球菌、放线杆菌等；厌氧菌主要是梭状芽胞杆菌、消化链球菌、普雷沃菌及双歧杆菌等[2]。全面了解正常健康女性阴道内菌群的结构及动态变化，有助于研究泌尿生殖道感染疾病的发生以及发展过程，辅助指导临床治疗和及时干预控制，同时也可以避免滥用各种药物而导致的耐药菌株产生。正常健康女性阴道内的菌群主要以乳杆菌为优势菌，其他杂菌少量共生；阴道的酸碱度一般维持在pH 3.8～4.5之间，当阴道微生态平衡被打破时，可使阴道内环境对病原微生物的抵抗力降低，导致继发感染发生[3]。

本研究由图10 Heatmap聚类分析可发现健康正常无性生活史女性阴道菌群结构在属水平主要的3个物种分别为乳杆菌属、小类杆菌属和普氏菌属，其中以乳杆菌属为主，说明乳杆菌属在健康正常无性生活史女性阴道菌群结构中起关键作用。自然界中有130多种乳杆菌能够产生乳酸，其中有20余种乳杆菌存在于女性的阴道内[4-5]，它们可以利用阴道内上皮细胞的糖原，通过代谢途径产生乳酸，使阴道的酸碱度维持在弱酸性水平，间接抑制了其他条件致病微生物及外界病原体的感染。而本研究检测到的乳杆菌属主要有3个物种，即瑞氏乳杆菌、惰性乳杆菌和罗伊乳杆菌。我们在研究男性前列腺炎疾病时发现对照组正常健康男性的尿道分泌物中也同样存在瑞氏乳杆菌和惰性乳杆菌，这两种菌究竟是否为男女泌尿生殖道共有菌有待进一步考证。Hoffman等[6]研究发现细菌性阴道炎是由于乳酸杆菌减少或缺失，导致阴道加德纳菌过度生长繁殖，并促使许多G-厌氧杆菌也过度生长。需氧菌性阴道炎主要是由金黄色葡萄球菌、B族溶血性链球菌、肠球菌、大肠埃希菌等需氧菌异常增殖导致的感染。由图6可见此次实验OTU在种水平共注释出19个物种，分别是Atopobiumvaginae、Campylobacterureolyticus、Clostridiumperfringens、Corynebacteriumkroppenstedtii、Escherichiacoli、Lactobacillushelveticus、Lactobacillusiners、Lactobacillusreuteri、Haemophilusparainfluenzae、Jonquetellaanthropi、Moryellaindoligenes、Neisseriasubflava、Peptostreptococcusanaerobius、Prevotellacopri、Prevotellamelaninogenica、Prevotellananceiensis、Streptococcusagalactiae、Streptococcusanginosus和Veillonella。正常健康女性阴道内经常是以一种或多种乳杆菌为优势菌，其中最常见的有詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌。在不同种族人群之间，其优势菌有明显的差异，白种人和亚洲人中80%～90%的优势菌都为乳杆菌，而在西班牙人和黑人中则不到60%[7]。Joo等[8]报道了目前乳杆菌中数量最多的是嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和发酵乳杆菌，它们既能起到自净作用，还能激活巨噬细胞，维持阴道局部的抗感染能力，对维持整个阴道菌群平衡起到关键性作用。哺乳、月经周期、妊娠、避孕、分娩和性生活等均能影响阴道菌群的微生态，本研究在健康正常无性生活史女性阴道分泌物中乳杆菌属仅检测出瑞氏乳杆菌、惰性乳杆菌和罗伊乳杆菌，与国内文献报道的妊娠期孕妇阴道菌群结构存在一定的差异[9]，推测性生活可能会直接或间接影响到乳杆菌属菌群的结构，或是因为地域、国家及人种不同，其原因有待进一步证实。本研究发现瑞氏乳杆菌和惰性乳杆菌在整个阴道分泌物菌群结构中所占的丰度是最高的，其中瑞氏乳杆菌最高达到99%，惰性乳杆菌最高达到90%。由图8样本间物种组成聚类分析和图9样本间Beta多样性分析结果可以看出29名健康正常无性生活史女性阴道分泌物中菌群结构整体比较相似，少数存在部分差异，说明个体差异较小，菌群结构比较稳定。本研究在健康正常无性生活史女性阴道分泌物中仅检出白假丝酵母和近平滑假丝酵母两种真菌，真核细胞型微生物种类数量偏少，这可能与随机取材有关。

女性阴道微生态检测主要包括功能学检测和形态学检测两部分[10]。功能学检测主要是通过测定女性阴道内微生物酶的活性以及代谢产物来判定微生物的功能状况。形态学检测内容主要是包括病原体、优势菌群、菌群密集度、多样性、白细胞数和各项疾病评分等指标。阴道的微生态评价目前主要是通过形态学和功能学两者相结合。当阴道内的优势菌、菌群密集度、多样性、酸碱度、阴道分泌物中白细胞等炎症指标和乳酸杆菌功能，其中任何一项出现异常，即可诊断为阴道微生态失调状态。一些病理情况如内分泌性疾病、感染性疾病、抗菌药物治疗、免疫抑制剂和化疗药物的使用等也可以打破阴道微生态的平衡。阴道微生态检测评价系统不仅能辅助诊断临床常见类型的阴道炎症，还能对阴道分泌物常规检查未发现特殊病原体，仅临床上有“外阴瘙痒和白带增多”等症状而难以诊断的患者提高诊断率[11]。阴道微生态检测评价系统既能准确诊断单纯性阴道感染，也能及时发现各种混合性阴道炎。全面评价阴道微生态环境，在明确诊断的基础上，感染治疗方面除按照诊治指南进行针对病原微生物的药物治疗外，还应用阴道微生态制剂恢复乳杆菌维持弱酸性环境的功能，减少阴道感染的反复发作[12]，通过修复阴道黏膜，恢复阴道内菌群微生态平衡是阴道感染治疗的最终目标之一。目前研究认为，微生态失调绝大部分只是暂时性的，当宿主免疫功能增强时即可恢复阴道微生态平衡；当外来病原体增加或机体抵抗力低下时，可导致炎症的发生。

本研究通过高通量二代测序技术全面了解健康正常无性生活史女性阴道内的微生物菌群结构，建立正常菌群物种数据库，对后续阴道疾病的诊治具有非常重要的意义。可以通过与正常菌群数据库的比对，发现差异物种，找到导致阴道疾病的病原体。对传统细菌培养方法无法鉴定的菌种后续也可以对其专门进行分离验证。