苦荞重组自交系群体粒重、粒形与蛋白组分含量的变异

郑俊青，黎瑞源，郑 冉，吕 丹，陈其皎，石桃雄，*，陈庆富

(贵州师范大学 a. 荞麦产业技术研究中心；b. 生命科学学院；c. 贵州省信息与计算科学重点实验室，贵州 贵阳 550001)

苦荞属于蓼科(Polygonaceae)荞麦属(FagopyrumMill)植物，又名鞑靼荞麦(tartary buckwheat)，其种植区域在我国主要分布在云南、四川、贵州、陕西、山西、甘肃和宁夏，我国的种植面积和产量均居世界第一[1]。苦荞作为自然界药食两用的作物，集生物类黄酮、微量元素和矿物质、淀粉、维生素、纤维素、脂肪和蛋白质于一身[2]。苦荞种子中的蛋白质含量是评价其营养品质的重要指标[3]。苦荞种子蛋白质是苦荞籽粒中主要的生物活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、降血压、抑制丝氨酸蛋白酶等生理活性，是一种理想的健康食品原料[4]。研究资料表明，苦荞和甜荞种子蛋白中含有的人体必需氨基酸齐全，且配比合理，是一种全价蛋白，具有较高的营养价值[5-6]。

种子成熟过程中合成并贮存大量的贮藏蛋白质，一般占种子总蛋白含量的80%左右[7]。Osborne[8]提取出种子贮藏蛋白质，并按照溶解性的不同将其分为清蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(gliadin)和谷蛋白(gluten)4类。荞麦蛋白组分含量表现为较高含量的清蛋白和谷蛋白，较低含量的球蛋白和醇溶蛋白[9-11]，不同于谷类作物小麦、水稻和玉米的蛋白组分含量(醇溶蛋白和谷蛋白含量高于清蛋白和球蛋白含量)[12-18]，与豆类作物蚕豆、绿豆蛋白组分含量(清蛋白含量较高)相近[19-22]。在食品加工方面，清蛋白和球蛋白可溶性强，富含赖氨酸，营养价值比较高，主要影响籽粒的营养品质，对加工品质的影响甚微[23-25]；醇溶蛋白主要影响面团的黏着性、延伸性[26]，影响荞麦的加工品质；谷蛋白主要决定面团的弹性[27]，对荞麦加工品质起决定性作用。与小麦和玉米等作物相比，苦荞的醇溶蛋白含量低，在制作发酵类主食时，不利于馒头或其他类面筋的形成[2]。郭荣荣[28]研究表明，甜荞谷蛋白对火腿肠的色泽具有显著影响，清蛋白影响火腿肠的凝胶强度，添加清蛋白和谷蛋白可以改善火腿肠的弹性和内聚性。在医疗保健方面，小麦、大麦等谷物中的醇溶蛋白是诱发乳糜泻肠道疾病的主要原因，荞麦的醇溶蛋白含量低，致病性低，是腹腔患者可以信赖和推崇的安全食物[29-31]。张超等[32]研究发现，苦荞球蛋白抗疲劳效果显著。左光明等[33]的研究表明，苦荞清蛋白降血脂和体内抗氧化功能较强。

苦荞粒形包括粒长、粒宽和长宽比等性状，是苦荞(米)外观品质性状的重要表现形式，同时也是决定粒重进而影响苦荞产量的重要因素。目前关于苦荞蛋白组分含量与粒重和籽粒性状相关性的研究报道较少。朱新产等[34]研究3个甜荞品种和3个苦荞品种发现，大粒荞麦(千粒重30～35 g)粗蛋白含量显著高于小粒荞麦(千粒重25～30 g)，说明千粒重影响营养品质。本研究以晋荞麦2号与小米荞杂交衍生获得的苦荞重组自交系(XJ-RILs)群体为试验材料，调查了该群体220个株系的粒形性状和蛋白组分含量的遗传变异，分析了籽粒性状和蛋白组分含量的相关性，筛选出各蛋白组分含量和总蛋白含量极端株系，为不同食品和保健品的加工需求提供材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以小米荞为母本，晋荞麦2号为父本，杂交衍生的重组自交系(XJ-RILs)群体220份F7:8株系为试验材料。小米荞是云南地方品种，薄壳，易脱壳，晚熟，适应性差，产量低；晋荞麦2号是山西省选育的高产优质品种，厚壳、不易脱壳，早熟，适应性强，产量高[35]。

1.2 田间种植

试验于2018年8月在贵州省贵阳市百宜镇试验基地进行，采用完全随机区组设计，包含3次重复，小区面积为2 m2，3行区种植，常规田间管理。

1.3 粒重和粒形测定

千粒重、粒长、粒宽和长宽比用SC-A型考种分析测定仪(杭州万深检测科技有限公司)进行测定。

1.4 蛋白提取

荞麦种子蛋白组分的提取采用顺序提取法。称取荞麦粉末0.500 g置于5 mL离心管中，先用0.01 mol·L-1Tris-HCl溶液(pH=7.5)提取清蛋白，再用0.01 mol·L-1Tris-HCl(pH=7.5)和0.5 mol·L-1NaCl混合溶液提取球蛋白；重新称取荞麦粉末0.500 g置于5 mL离心管中，先用60%正丙醇溶液提取醇溶蛋白，再用0.5%酒石酸钠、0.24%硫酸铜、1.68%氢氧化钾和50%正丙醇混合溶液提取谷蛋白。具体的提取步骤参考张启迪等[36]的方法。

1.5 清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和总蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝G-250染色法测定苦荞种子中各蛋白组分含量。总蛋白含量近似为4种蛋白组分含量之和。

1.6 数据处理

苦荞XJ-RILs群体各性状的平均值、最大值、最小值、峰度、偏度、变异系数等描述统计量采用Excel 2016进行分析，用SPSS 24.0进行亲本间各性状的方差分析、XJ-RILs群体各性状的简单相关性分析、类群间的方差分析(F检验)、多重比较(Duncan法)。分别用R3.2.2统计软件(https://www.R-project.org/)的scale、dist和hclust函数完成群体各性状的标准化和中心化、基于欧氏距离的相似性矩阵构建和基于离差平方和法(Ward)的聚类分析。

2 结果与分析

2.1 苦荞XJ-RILs群体粒形与蛋白组分含量变异

亲本间各调查性状的方差分析(表1)表明，父本晋荞麦2号千粒重、粒长、粒宽、长宽比、清蛋白、球蛋白、谷蛋白和总蛋白含量均显著(P<0.05)高于母本小米荞；双亲间醇溶蛋白含量无显著性差异(P>0.05)。双亲蛋白组分含量高低清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。

苦荞XJ-RILs群体粒形性状中，千粒重变幅为11.88～26.73 g，平均值为18.17 g；粒长变幅为4.05～5.73 mm，平均值为4.87 mm；粒宽变幅为2.78～3.64 mm，平均值为3.14 mm；长宽比变幅为1.27～1.90，平均值为1.57。千粒重的变异系数最大，为17.13%；其次是长宽比和粒长，分别为10.62%和9.03%；粒宽的变异系数最小，为5.79%。

苦荞XJ-RILs群体蛋白组分中，总蛋白含量变幅为44.61～114.20 mg·g-1，平均值为75.90 mg·g-1；清蛋白含量变幅为10.29～56.39 mg·g-1，平均值为34.10 mg·g-1；球蛋白含量变幅为5.68～13.48 mg·g-1，平均值为10.84 mg·g-1；醇溶蛋白含量变幅为2.51～7.42 mg·g-1，平均值为4.95 mg·g-1；谷蛋白含量变幅为7.83～47.20 mg·g-1，平均值为26.01 mg·g-1。谷蛋白含量变异系数最大，为29.97%；其次是清蛋白含量和醇溶蛋白含量，分别为24.03%和20.15%；再次是球蛋白含量，为16.07%；总蛋白含量变异系数最小，为15.30%。

粒长和长宽比的峰度绝对值均大于1，呈现近似的正态分布；其他7个性状的偏度和峰度绝对值均小于1，符合正态分布。各性状均存在明显的双向超亲分离现象(图1，表1)。

2.2 苦荞XJ-RILs群体种子蛋白组分含量的基因型差异

苦荞XJ-RILs群体种子蛋白组分含量存在明显基因型差异，按照种子蛋白组分含量高低顺序分为5种类型(表2)。其中，有160个株系(72.73%)和亲本一致，各蛋白组分含量高低为清蛋白含量>谷蛋白含量>球蛋白含量>醇溶蛋白含量，谷蛋白含量的变异系数最大(27.65%)，总蛋白含量的变异系数最小(14.94%)；53个株系(24.09%)的谷蛋白含量>清蛋白含量>球蛋白含量>醇溶蛋白含量，其中醇溶蛋白含量的变异系数最大(23.03%)，总蛋白含量的变异系数最小(14.10%)；4个株系(1.82%)的清蛋白含量>球蛋白含量>谷蛋白含量>醇溶蛋白含量；2个株系的谷蛋白含量>清蛋白含量>醇溶蛋白含量>球蛋白含量；还有1个株系的清蛋白含量>谷蛋白含量>醇溶蛋白含量>球蛋白含量。

表1 苦荞XJ-RILs群体粒重、粒形与蛋白组分含量变异

2.3 苦荞XJ-RILs群体粒形与蛋白组分含量简单相关性分析

各性状的简单相关性分析表明(表3)，千粒重与粒长、粒宽，以及球蛋白、谷蛋白和总蛋白含量呈极显著(P<0.01)正相关，与清蛋白呈显著(P<0.05)正相关，与醇溶蛋白呈极显著(P<0.01)负相关；粒长与长宽比、谷蛋白含量呈极显著(P<0.01)正相关，与总蛋白含量呈显著(P<0.05)正相关，与醇溶蛋白含量呈极显著(P<0.01)负相关；粒宽与球蛋白、总蛋白含量呈极显著(P<0.01)正相关，与长宽比呈极显著(P<0.01)负相关；长宽比与醇溶蛋白含量呈极显著(P<0.01)负相关，与谷蛋白呈显著(P<0.05)正相关。清蛋白、球蛋白和谷蛋白均与总蛋白呈极显著(P<0.01)正相关；谷蛋白与球蛋白呈显著(P<0.05)正相关，与醇溶蛋白呈显著(P<0.05)负相关。

2.4 苦荞XJ-RILs群体粒形与蛋白组分含量聚类分析

基于调查性状的表型值对苦荞XJ-RILs群体进行聚类分析。结果显示，在欧氏距离为12.10～13.50处，可将220个株系划分为12个类群(图2)。类群间各性状的方差分析(表4)表明，C7、C8、C10、C11和C12类群的千粒重显著(P<0.05)高于其他7个类群，均值分别为19.83、20.90、21.11、20.81、20.01 g；C9、C11和C12类群的粒长显著(P<0.05)高于其他9个类群，均值分别为5.36、5.42、5.39 mm；C8类群的粒宽显著(P<0.05)高于其他11个类群，均值为3.45 mm；C4、C9、C11和C12类群的长宽比显著(P<0.05)高于其他8个类群，均值为1.72、1.75、1.75和1.75；C7和C9类群的清蛋白含量显著(P<0.05)高于其他10个类群，均值分别为45.70 mg·g-1和42.59 mg·g-1；C3、C8、C10和C11类群的球蛋白含量显著(P<0.05)高于其他8个类群，均值分别为11.71、11.81、11.58、12.08 mg·g-1；C2、C3、C5、C6、C8和C11类群的醇溶蛋白含量显著(P<0.05)高于其他6个类群，均值分别为5.86、5.31、5.76、5.46、5.42、5.74 mg·g-1；C6和C10类群的谷蛋白含量显著(P<0.05)高于其他10个类群，均值分别为35.11 mg·g-1和37.10 mg·g-1；C6、C9和C10类群的总蛋白含量显著(P<0.05)高于其他9个类群，均值分别为88.87、89.31、85.74 mg·g-1。

白色箭头代表小米荞；黑色箭头代表晋荞麦2号。White arrows indicated the value of Xiaomiqiao; Dark arrows indicated the value of Jinqiaomai 2.图1 苦荞XJ-RILs群体粒重、粒形与蛋白组分含量频率分布Fig.1 Frequency distribution of grain weight， grain shape and protein content and component in the XJ-RILs population of tartary buckwheat

表2 苦荞XJ-RILs群体蛋白组分含量差异

表3 苦荞XJ-RILs群体粒重、粒形与蛋白组分含量简单相关系数

C9类群的28个株系的长宽比和总蛋白含量最高，均值分别为1.75和89.31 mg·g-1，粒长和清蛋白含量均较高，均值分别为5.36 mm和42.59 mg·g-1；C10类群的13个株系千粒重和谷蛋白含量最高，均值分别为21.11 g和37.10 mg·g-1，球蛋白和总蛋白含量较高，均值分别为11.58 mg·g-1和85.74 mg·g-1；C11类群的10个株系粒长、长宽比和球蛋白含量最高，均值分别为5.42 mm、1.75和12.08 mg·g-1，千粒重和醇溶蛋白含量均较高，均值分别为20.81 g和5.74 mg·g-1。

3 结论与讨论

遗传参数中的变异系数可在一定程度上反映性状的多样性，变异系数越大，多样性程度越高。一般情况下，变异系数大于10%，说明该性状遗传多样性丰富[37]。本文苦荞XJ-RILs群体千粒重的变异系数最大(17.13%)，接近该群体F5家系[38]和F6家系[39]的千粒重变异系数(分别为15.18%和15.90%)，高于翅米荞×野苦荞RILs群体百粒重变异系数(9.06%)[40]和苦荞种质资源百粒重变异系数(13.67%)[41]，说明该群体千粒重变异较为丰富；长宽比变异系数次之，为10.62%，这与苦荞种质资源长宽比变异系数(11.42%)[41]相近，低于翅米荞×野苦荞RILs群体长宽比的变异系数15.24%[40]。苦荞XJ-RILs群体蛋白组分中，谷蛋白含量的变异系数最大，其次分别为清蛋白、醇溶蛋白和球蛋白，总蛋白变异系数最小，各蛋白组分均具有丰富的遗传多样性，有利于苦荞不同蛋白组分含量株系的选育。除粒长和长宽比外，千粒重、粒宽和各蛋白组分含量均呈近似的正态分布，说明千粒重、粒宽和蛋白组分含量为多基因控制的数量性状，而粒长、长宽比呈双峰分布，说明可能存在控制该性状的主效基因。

图2 苦荞XJ-RILs群体粒重、粒形与蛋白含量及其组分的聚类图Fig.2 Dendrogram of XJ-RILs population in tartary buckwheat based grain weight， grain shape and protein content and components

表4 苦荞XJ-RILs群体12个类群间粒重、粒形与蛋白组分含量的差异分析

续表4 Continued Table 4

苦荞XJ-RILs群体蛋白组分含量的特点为较高含量的清蛋白和谷蛋白，较低含量的球蛋白和醇溶蛋白。220个株系中，有160个株系(72.73%)的蛋白组分含量为清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白，这与刘拥海等[3]研究的5个苦荞品种结果一致。有2个株系的蛋白组分含量为谷蛋白>清蛋白>醇溶蛋白>球蛋白，这与汪燕等[10]研究的20个苦荞品种结果一致。有1个株系的蛋白组分含量为清蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白>球蛋白，这与郭晓娜等[11]研究的苦荞结果一致，表明该群体蛋白组分含量存在丰富的基因型差异，有利于优异株系的筛选。

苦荞XJ-RILs群体粒重与粒形性状的相关性分析表明，千粒重与粒长呈极显著正相关(r=0.567)，这与李春花等[42]对苦荞的研究结果一致，也与水稻[43-45]和大麦[46]中的研究结果一致；千粒重与粒宽呈极显著正相关(r=0.709)，表明粒宽对千粒重的影响更显著。千粒重与球蛋白、谷蛋白、总蛋白呈极显著正相关，与清蛋白呈显著正相关，与醇溶蛋白呈极显著负相关；粒长与谷蛋白呈极显著正相关，与总蛋白呈显著正相关，与醇溶蛋白呈极显著负相关；粒宽与球蛋白、总蛋白呈极显著正相关；长宽比与醇溶蛋白呈极显著负相关，与谷蛋白呈显著正相关。

基于苦荞XJ-RILs群体调查性状的表型值，将220个株系聚为12个类群，为了筛选得到粒形和蛋白组分极端株系和综合性状良好的株系，对类群间各性状进行方差分析。结果表明，C7类群的12个株系和C9类群的28个株系是清蛋白极高端类群；C11类群的10个株系是球蛋白含量极高端类群。籽粒清蛋白和球蛋白含量极高端类群可为高营养品质荞麦食品的加工和抗疲劳、降血脂、抗氧化保健品的加工提供重要材料。C2类群的12个株系、C5类群的10个株系和C11类群的10个株系是醇溶蛋白极高端类群；C12类群的28个株系是醇溶蛋白含量极低端类群。C6类群的17个株系和C10类群的13个株系是谷蛋白含量极高端类群；C5类群的10个株系是谷蛋白含量极低端类群。籽粒醇溶蛋白和谷蛋白极高端类群适合加工为荞麦面条、馒头和面包等，极低端类群可以作为腹腔疾病患者的安全食物。C6类群的17个株系和C9类群的28个株系是总蛋白含量极高端类群。C9类群的28个株系粒长、长宽比、清蛋白和总蛋白含量均较高；C10类群的13个株系千粒重、球蛋白、谷蛋白和总蛋白含量较高；C11类群的10个株系千粒重、粒长、长宽比、球蛋白和醇溶蛋白含量均较高，可作为千粒重、粒长、长宽比、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和总蛋白含量综合性状优良株系，可为不同食品、保健品的加工需求提供材料。