基于小鼠粪便气味信息的牛乳清蛋白功能效果的鉴别区分

龙 鸣，张 棚，刘元林，摆小琴，张福梅，田晓静，*，曹 竑，周雪雁，马忠仁，罗 丽，宋 礼， Nurul Izza NORDIN

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124； 2.西北民族大学 生物医学研究中心中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州 730030； 3.甘南州牦牛乳研究院，甘肃 合作 747000； 4.Industrial Biotechnology Research Centre， SIRIM Berhad， Shah Alam， Selangor 40700， Malaysia)

乳清蛋白(whey protein)是乳中除酪蛋白外多种蛋白质组分的统称，具有促进蛋白质合成、矿物质吸收、降低血糖[1]、降低血压[2]和血脂水平[3]、抑菌[4]、抗癌[5]和抗氧化[6]等功能，可维持机体健康和修复损伤，还可提高菌群多样性，提高或维持肠道益生菌的相对丰度，同时降低肠道有害菌群的丰度[7-8]。作为公认的人体优质蛋白质补充剂之一，乳清蛋白在临床治疗上适用于维持和提高机体免疫力，抗自由基、延缓人体衰老进程，提升肾功能，促进伤口愈合等疾病[9-10]。目前，对于乳清蛋白的功能特性研究，主要是通过建立动物模型实验和人体临床试验进行探究，对实验动物的依赖大[11]，为获取生理生化与形态学指标需处死实验动物，与动物保护主义背道而驰，且分析过程繁琐，消耗大量人力、物力和财力；因此，对实验动物实施快速、无创的评价具有重要的科学意义。

电子鼻(electronic nose，E-nose)利用气敏传感器阵列对挥发性气味物质的响应来识别简单和复杂气味信息[12]，已在食品[13]、农产品品质[14]中广泛应用。粪便是机体整体代谢终产物输出的主要途径之一，其代谢物的变化不仅能够反映机体整体代谢的特征，还是膳食和营养调节影响的外在表现[15]。目前，基于代谢物中挥发性成分呈味电子鼻检测的研究主要包含食品功能性成分体内功效评价及其代谢监控等，仅限于针对外部条件对粪便挥发性代谢物气味的影响[16-18]、功能成分体内评价[19-20]、肠道菌群结构预测[21]等方面。利用粪便挥发性气味物质的气味信息无创评价食品体内功能性的研究较少。

本研究旨在探讨通过电子鼻监测小鼠粪便样品气味信息快速无损评价牛乳清蛋白干预对衰老小鼠的影响，进而为基于粪便气味评价食品功能性奠定基础。本文以衰老模型小鼠为研究对象，采用电子鼻追踪牛乳清蛋白干预小鼠粪便气味，同时监测小鼠体重、周龄；结合模式识别方法评价气味信息对小鼠的影响，并建立小鼠体重的定量预测模型。本研究的结果可为突破依靠传统生化指标进行功效区分评价的模式提供思路与技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

1.1.2 实验试剂

D-半乳糖与维生素C(VC)购买自美仑生物，生理盐水(NS)购买自四川科伦药业股份有限公司，鲜牛乳购于兰州伊利乳业有限责任公司，超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 检测指标

SOD 活性测定采用羟胺法；MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸比色(TBA) 法。体重增长率(%)=(乳清蛋白干预不同周数后体重-乳清蛋白干预前体重)/乳清蛋白干预前体重×100。胸腺/体重(mg·g-1)=乳清蛋白干预后胸腺质量(mg)/乳清蛋白干预后体重(g)。

1.1.4 仪器

检测仪器采用德国AIRSENSE公司的PEN3型便携式电子鼻。主要包括以下硬件部分：传感器阵列(包含10个金属传感器，其属性见表1)、采样与清洗通道、数据采集系统和计算机组成。

文中提出一种小尺寸三陷波超宽带天线，天线的整体尺寸为28 mm×24 mm×1.524 mm，结构简单，易于加工制作和系统集成。在矩形加等边梯形的辐射贴片上通过刻蚀U型缝隙，C型缝隙以及增加一对U型旁支结构实现在3.3～3.8 GHz，5～6.1 GHz，7.9～8.8 GHz 3个频段上的陷波特性，分别有效抑制了WiMAX系统，WLAN系统和ITU信号对于UWB系统的干扰。该天线在整个工作频段具有辐射特性级增益，符合UWB通信要求，具有很好的研究前景。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

按随机数字表将实验小鼠分为6组，每组9只小鼠，分组见表2。

1.2.2 牛乳清蛋白制备

鲜牛乳于4 ℃、5 000 r·min-1离心30 min，弃去上层乳脂，脱脂乳在室温下用1 mol·L-1的HCl调pH至4.6，40 ℃水浴20 min后于4 ℃、8 000 r·min-1离心20 min，收集上清液。将上清液冷冻干燥，备用。

1.2.3 衰老动物模型制备与牛乳清蛋白抗衰老治疗

表1 电子鼻传感器阵列与性能

表2 动物分组表

对VC组、NS组、CWP-L组、CWP-M组和CWP-H组实验小鼠，颈背部皮下注射10%D-半乳糖生理盐水注射液1.25 mg·g-1·d-1，连续6周制备衰老小鼠。实验组牛乳清蛋白灌胃给药按照低(每只100 mg·kg-1·d-1)、中(每只200 mg·kg-1·d-1)、高(每只400 mg·kg-1·d-1)3个浓度梯度；VC阳性对照组按每只300 mg·kg-1·d-1给药，衰老空白对照组给予同等体积的NS，自然空白组给予同等体积的NS。持续7周，各组在给药的同时，持续给予D-半乳糖生理盐水颈背部皮下注射。

1.2.4 指标检测

乳清蛋白干预7周后，检测体重。小鼠断头采血，4 ℃静置2 h， 3 500 r·min-1离心15 min。检测血清中SOD和MDA，小鼠解剖分离胸腺，称重。

1.2.5 电子鼻检测方法

样品收集：将小鼠置于洁净鼠笼，以牛乳清蛋白干预7周，每隔7 d收集粪便每笼收集40粒粪便，置于5 mL无菌离心管，-80 ℃保存备用。实验前，将样品恢复至室温，进行电子鼻检测。

电子鼻检测：电子鼻响应信号受样品量、顶空生成时间、顶空生成体积及载气流速等因素影响，故采用单因素实验优化实验条件(表3)。每次检测，取粪便样品于烧杯中，保鲜膜封口静置一定时间，使其生成一定的顶空气体，后进行电子鼻检测，每组样品 40 个平行，设定电子鼻信号采集时间60 s，清洗时间80 s，本研究均选取传感器稳态第59秒响应值进行后续分析。

1.3 数据统计分析方法

表3 电子鼻单因素试验水平表

采用典则判别分析(canonical discriminant analysis，CDA)和方差(one-way ANOVA)分析，以确定较佳的电子鼻检测参数。采用CDA和主成分分析(principal component analysis，PCA)综合判别不同灌胃给药物和不同灌胃给药周数小鼠粪便的差异。采用典型相关分析(canonical correlation analysis，CCA)，综合判别小鼠粪便电子鼻气味信息与其生理指标的相关性。采用多元线性回归模型(multiple linear regression，MLR)建立电子鼻信号与小鼠的体重变化和衰老周期的关联关系。数据分析采用Excel、SPSS 16软件和SAS V8软件分析，由Origin8 Pro 制图。

2 结果与分析

2.1 小鼠生理指标检测结果

牛乳清蛋白对小鼠血清中SOD、MDA和脏器指数、体重变化率的影响，结果见表4。NS-N组、VC组、CWP-L组、CWP-M组和CWP-H组与NS组相比，血清中的SOD活性均升高，MDA显著含量均降低，表明牛乳清蛋白和VC在小鼠血清中一样具有抗氧化的能力，且抗氧化能力的强弱与小鼠的给药量存在一定关系。给药牛乳清蛋白各试验组小鼠的胸腺指数与NS组比较，差异均显著，与NS-N组比较，差异均不显著，说明牛乳清蛋白对小鼠胸腺指数没有影响，对小鼠的组织器官没有毒害作用。

表4 小鼠生理指标检测结果

2.2 电子鼻检测较佳条件优化确定

2.2.1 样品量对电子鼻响应信号的影响

取粪便样品于顶空生成时间为10 min、顶空生成体积250 mL、300 mL·min-1载气流速、采样60 s，清洗80 s，研究样品量(1、2、3粒)对电子鼻传感器响应信号的影响。方差分析和CDA结果见表5和图1-a。方差分析结果表明：样品量对传感器S4、S7、S8和S9的影响统计学差异极显著(P<0.01)，传感器S2和S3的影响统计学差异显著(P<0.05)，其他传感器影响不显著。图1-a中，CDA分析结果第一主成分占72.51%，第二主成分占27.49%，总贡献率为100%，能反映全部原始数据信息。样品量2粒和样品量3粒组数据点有部分重叠，样品量1粒的数据能与样品量2粒和样品量3粒组的数据有很好地区分，且样品量1粒组的数据点较为集中，所以选择1粒老鼠粪便作为较佳的样品量。

2.2.2 顶空生成时间对电子鼻响应信号的影响

取粪便样品1粒、顶空生成体积250 mL、载气流速300 mL·min-1、采样时间60 s，清洗80 s，研究顶空生成时间(5、10、15 min)对电子鼻传感器响应信号的影响。方差分析和CDA结果见表5和图1-b。方差分析结果表明：顶空生成时间对传感器S1、S3、S6、S7、S8、S9和S10影响极显著(P<0.01)；对传感器S2和S4的影响显著(P<0.05)，对传感器S5影响不显著。CDA结果中第一成分占94.32%，第二主成分占5.68%，总贡献率为100%，能反映全部的原始数据信息。图1-b中，5 min和15 min彼此有较多重叠；10 min数据组能与5 min和15 min组的数据有很好的区分；且10 min组的数据点聚集性较好，故选择10 min作为较佳的顶空生成时间。

表5 单因素方差分析结果

图1 电子鼻单因素实验的CDA分析结果Fig.1 CDA analysis results of E-nose single factor experiment

2.2.3 顶空生成体积对电子鼻响应信号的影响

取粪便样品1粒、顶空生成时间10 min、载气流速300 mL·min-1、采样时间60 s、清洗80 s，研究顶空生成体积(150、250、500 mL)对电子鼻传感器响应信号的影响。方差分析和CDA结果见表5和图1-c。由方差分析结果表明：顶空生成体积对传感器S2影响不显著(P>0.05)，对传感器S5影响显著(P<0.05)，对其余8个传感器的影响极显著(P<0.01)。CDA结果中第一主成分占94.10%，第二主成分占5.90%，总贡献率为100%，能代表全部原始数据信息。图1-c中，不同顶空生成体积的数据点中，虽150 mL和250 mL彼此有重叠；但从数据点的聚集性来看，150 mL的数据点相较于另两组数据点更为集中，所以选择150 mL作为较佳的顶空生成体积。

2.2.4 载气流速对电子鼻响应信号的影响

取粪便样品1粒、顶空生成时间10 min、顶空生成体积250 mL、采样时间60 s，清洗80 s，研究载气流速(200、300、400 mL·min-1)对电子鼻传感器响应信号的影响。方差分析和CDA结果见表5和图1-d。方差分析结果表明：除载气流速对传感器S5影响不显著(P>0.05)外，对其余9个传感器的影响极显著(P<0.01)。CDA结果中第一主成分占72.77%，第二主成分占27.23%，总贡献率为100%，能反映全部的原始数据信息。图1-d中，不同载气流速数据点较为分散且相互之间都有交叠；但从数据点的聚集性来看，200 mL·min-1数据组优于另外两组，故选择200 mL·min-1作为较佳的载气流速。

2.3 小鼠粪便气味信息传感器特征响应曲线

在2.2节优化的检测条件下，每隔1周检测采集的表2中不同灌胃给药小鼠的粪便样品气味信息。图2给出了NS-N、VC、NS、CWP-L、CWP-M、CWP-H组小鼠粪便样品第7 周的电子鼻特征响应曲线。如图2所示，横坐标为检测时间，纵坐标为10根传感器响应信号。检测初期，传感器对小鼠粪便样品中的挥发物迅速响应，但基本都在40 s之后逐渐趋于平衡；而不同灌胃给药物的小鼠粪便样品对信号强度的响应信号有所不同：对NS-N组和VC组小鼠粪便样品对传感器S7的响应最为强烈，其次为S6；而NS、CWP-L、CWP-M和CWP-H组的小鼠粪便样品对S6传感器的响应最为强烈，其次为S7。这为基于电子鼻信息检测区分不同灌胃给药物的小鼠粪便及其7周变化的判别区分奠定了基础。

图2 不同灌胃给药组小鼠粪便样品的电子鼻特征响应信号(第7周)Fig.2 Characteristic sensor response signals of fecal samples of mice in different groups (7th week)

2.4 定性识别不同灌胃给药小鼠粪便样品

对NS-N组、VC组、NS组、CWP-L组、CWP-M组和CWP-H组小鼠粪便样品传感器第59 秒响应，采用SAS软件进行PCA和CDA判别，结果见图3。从图3-a可知，第一主成分61.48%、第二主成分23.85%和第三主成分9.89%，共解释了原始变量95.22%的信息；PCA基本可将6种干预小鼠粪便有效区分，且不同干预组数据点呈现规律性分布，即右侧的牛乳清蛋白组(CWP-L组、CWP-M组和CWP-H组)和左侧对照组(NS-N组、VC组和NS组)。图3-b CDA结果，第一主成分为65.62%，第二主成分为17.35%，共解释了原始变量82.97%的信息；除部分数据点重叠外，CDA基本可将对6种干预小鼠粪便样品彼此区分，且数据点组内集聚，结合PCA和CDA，利用粪便的电子鼻气味可以实现鉴别不同干预小鼠粪便的气味，为基于气味信息的食品体内功能性评价提供基础。

2.5 定性识别不同灌胃给药周期小鼠粪便样品

对CWP-L组、CWP-M组和CWP-H组灌胃给药7周小鼠粪便样品传感器第59秒响应，采用SAS软件进行CDA判别，结果见图4。从图4-a可知，CWP-L组CDA结果第一主成分61.74%、第二主成分20.78%，共解释了原始变量82.52%的信息；CWP-M组CDA结果第一主成分68.10%、第二主成分18.87%，共解释了原始变量86.97%的信息；CWP-H组CDA结果第一主成分83.82%、第二主成分13.36%，共解释了原始变量97.18%的信息；除部分数据点重叠外，CDA基本可将灌胃给药低(a)、中(b)、高(c)浓度牛乳清蛋白的小鼠粪便样品7周小鼠粪便有效区分，且不同周数组数据点呈现规律性分布，即从右向左依次递增灌胃给药周数(0周组、1周组、3周组、5周组和7周组)，数据点组内集聚。通过CDA，可利用粪便的电子鼻气味实现鉴别不同干预周数小鼠粪便的气味。

图3 不同灌胃给药小鼠粪便样品的电子鼻PCA(a)和CDA(b)判别结果(第7周)Fig.3 The results of PCA(a) and CDA(b) discrimination of mice feces treated by different intragastric administration(7th week)

图4 灌胃给药低(a)、中(b)、高(c)浓度牛乳清蛋白的小鼠粪便样品7周气味信息变化的电子鼻CDA判别结果Fig.4 The results of electronic nose CDA discriminating the change of odor information in the fecal samples of mice with bovine whey protein at low (a)， medium (b) and high (c) concentrations administered by gavage for 7 weeks

2.6 与其生理指标相关关系

结合小鼠第7周的粪便气味信息与生理指标，通过典型相关分析，如图5所示，热图中表明生理指标SOD与传感器S1、S2、S3、S6、S7、S8和S10有极显著(P<0.01)相关性，与S4、S5有显著(P<0.05)相关性；MDA与传感器S4、S7和S9有极显著(P<0.01)相关性，与S2、S6有显著(P<0.05)相关性；体重增长率与S1、S2、S4、S7、S8、S10有极显著(P<0.01)相关性，与S3有显著(P<0.05)相关性；胸腺指数与传感器S1、S3、S4、S6、S7、S8、S9、S10有极显著(P<0.01)相关性；表明小鼠的粪便电子鼻气味信息与其生理指标两者有着极好的相关性，为通过基于电子鼻信息检测不同灌胃给药物的小鼠粪便气味信息构建预测其体重变化率模型奠定了基础。

图5 小鼠粪便电子鼻气味信息与其生理指标的相关关系(第7周)Fig.5 Correlation between the odor information of mouse fecal electronic nose and its physiological indicators (7th week)

2.7 定量预测小鼠的周期体重变化

为跟踪不同干预阶段小鼠体内变化，采用多元性回归分析(MRL)建立了老小鼠周期体重的预测模型(图6)。

对小鼠体重，建立的MRL预测模型方程为：

y1=12.002S1-1.119S2-71.716S3-5.095S4+3.075S5+0.303S6+0.239S7-1.252S8-10123S9-8.621S10+110.732。

(1)

式(1)中：y1为小鼠体重；S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10为各传感器的特征值。

图6 MRL定量预测小鼠体重变化模型Fig.6 Predictive model built by MLR for body weight

3 结论与讨论

营养补充可影响肠道菌群结构，乳清蛋白可提高菌群多样性，还可提高或维持肠道益生菌的相对丰度，同时降低了肠道有害菌群的丰度[7]。肠道菌群结构的变化进而影响代谢产物组成和含量的差异[22-23]，外部表现为气味的变化。通过电子鼻监控粪便气味变化，反映肠道菌群结构的变化，进而反应营养补充或膳食干预的作用仅有初步尝试研究。

因粪便中挥发性代谢物的电子鼻响应信号受外部条件的影响，如性别、年龄、体质指数(BMI)、抽烟史、饮食、合并疾病及用药等生活方式[17]，本研究通过方差分析结合CDA研究了不同因素对电子鼻传感器响应的影响，优化获得小鼠粪便气味信息电子鼻检测的条件为：粪便样品1粒、顶空生成时间10 min、顶空生成体积150 mL和进样流速200 mL·min-1。对粪便气味信息，李书艺等[19]在其研究中发现的荔枝壳原花青素低聚体灌胃SD大鼠粪便的气味响应明显低于空白组样品；综合3个观测时间点粪便气味信息，El Manouni el Hassani等[18]发现母乳(BM)和配方奶粉(FM)2种喂养方式早产儿粪便挥发性组分气味差异显著；本研究发现，对不同干预小鼠粪便，其电子鼻气味信息强度均有差异。结合多元统计分析方法综合分析电子鼻气味信息时发现，电子鼻信息结合PCA和CDA，均可将对应小鼠粪便样品判别区分，基于气味评价不同营养干预具有可信性，这与葛茵等[21]对肠道发酵液气味的定性区分效果相似。基于肠道发酵液样品的气味指纹，葛茵等[21]构建了菌门数据的预测模型；本研究采用多元线性回归模型建立了小鼠体重预测模型，其决定系数(R2)值为0.122 7，效果尚可；但通过典型相关分析结果表明，粪便电子鼻气味信息与其生理指标两者有着极好的相关性，关联性较强，为今后基于气味信息评价体内指标提供理论支撑，基于粪便中挥发性代谢物的传感器响应无创评价乳清蛋白体内活性具有可行性。