黑木耳菌糠基质下毛木耳细胞工程菌株的生殖生长

刘微，徐凡，杨超上，耿丹萌，张铁军，王谦

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.承德市农业农村局 农业环境保护监测站，河北 承德 067000)

毛木耳[Auriculariapolytricha(Mont.) Sacc.][1]隶属真菌界Eumycetes、真菌门Eumycophyta、担子菌亚门Basidiomycotina、层菌纲Hymenomycetes、木耳目Auriculariales、木耳科Auriculariales、木耳属Auricularia，是一种中高温型食药兼用蕈菌[2].毛木耳含有丰富的多糖，具有抗肿瘤[3]、抗凝血[4]、抗氧化[5]、降血脂[6]功能和免疫调节[7]活性.此外，每100 g袋栽毛木耳干品中含水分9.3 g、粗蛋白9.1 g、粗脂肪0.6 g、碳水化合物69.2 g、粗纤维9.7 g、灰分2.1 g.在灰分中含钙145.0 mg、磷181.1 mg、铁52.0 mg，还含有硫胺素、核黄素、抗坏血酸、胡萝卜素等维生素，人体红细胞中血色素的结构物——铁质，毛木耳中含量比肉类高30多倍，钙含量是肉类的25倍[8].

黑木耳菌糠是黑木耳采摘后废弃的固体培养基质，但仍具有丰富的营养价值，其粗蛋白和粗纤维的含量比平菇、香菇等其他一些常见的食用菌菌糠高[9]；黑木耳现在成为国内栽培规模最大的品种，产业发展产生的菌糠成为随之出现需要解决的问题，其资源化利用成为科技部、农业农村部引导的本领域重点研发方向之一；但是目前，黑木耳菌糠大部分被丢弃在田间地头、河流两岸，不但造成资源浪费，还会造成环境污染[10].河北省黑木耳主产区多分布在贫困地区，其菌糠除带来生态胁迫外，资源化开发也具有科技扶贫的社会效益；毛木耳恰恰可以发挥其分解能力好、抗逆性强的品种优势对黑木耳菌糠进行生物降解，不仅有效地降低了面源污染，还从经济效益和社会效益方面，提供了新的发展思路与技术途径.

育种是产业的核心工作，本单位采用ARTP诱变技术[11]选育出优良毛木耳细胞工程菌株新河大SL205，已于2019年12月通过河北省科技成果第三方评价，其选育工作另文报道；在此，主要探讨黑木耳菌糠资源化开发中毛木耳新河大SL205生殖生长的优化利用创新技术，该创新已经查新报告确认；相关工作已经在河北省相关贫困地区完成示范研究.

1 实验材料

1.1 供试菌种及材料

供试菌株：毛木耳新河大SL205，河北大学食药用真菌研究所保藏.

对照菌株：毛木耳3号，河北大学食药用真菌研究所保藏.

供试材料：黑木耳菌糠，由河北省隆化县德隆食用菌有限公司提供；杂木屑、棉籽皮、玉米芯、麸皮、石灰等市售.

1.2 供试培养基

PDA(potato dextrose agar)培养基：马铃薯20%(质量分数，下同)，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然.

原种培养基：杂木屑40%(质量分数，下同)，棉籽皮20%，玉米芯20%，麸皮18%，石灰2%.

生殖生长培养基配方见表1.

表1 黑木耳菌糠培养基的5个配方处理

2 实验方法

2.1 黑木耳菌糠、杂木屑、玉米芯营养成分的测定

2.1.1 全碳、全氮质量分数的测定

采用重铬酸钾滴定法[12]测定全碳质量分数，采用凯氏定氮法[13]进行全氮质量分数的测定.

2.1.2 粗纤维、粗灰分质量分数的测定

采用酸碱洗涤法[14]进行粗纤维质量分数的测定，采用马弗炉法[15]进行粗灰分质量分数的测定.

2.2 供试菌株与对照菌株在黑木耳菌糠培养基上的品比

2.2.1 长速长势对比

矿权范围内圈定70个金矿体，全部为盲矿体，根据矿石氧化程度分类，矿石类型全部为原生矿。岩性为黄铁绢英岩化碎裂岩和黄铁绢英岩化花岗质碎裂岩，矿石结构以自形—半自形晶粒状结构和碎裂结构为主，其次为包含结构，填隙结构等。矿石构造主要有浸染状构造、细脉状构造、块状构造、条带状构造和斑状构造等。矿石矿物成分由金属矿物、非金属矿物组成，其中金属矿物主要有黄铁矿、黄铜矿、方铅矿、闪锌矿、自然金、银金矿等，非金属矿物主要有石英、绢云母、长石、方解石等[8-10]，其中金矿物呈亮黄色，粒状—不规则状，粒径一般在0.01～0.03mm，主要包含黄铁矿或分布在黄铁矿晶隙、裂隙脉石矿物粒间或脉石矿物中(图5)。

黑木耳采耳结束后，菌丝洁白、无污染的黑木耳菌棒粉碎成小颗粒，经阳光晒干后备用.

供试菌株与对照菌株各挑取长势相同、大小接近的菌块，在无菌环境下接种于黑木耳菌糠培养基的试管中，每株5个平行，3次重复，将接种后的试管做好标记后放置于26 ℃恒温培养箱中培养，待菌丝萌发长齐后开始划线，每5 d划线1次，观察菌丝长速.

菌丝长速(mm/d)=菌丝生长长度/菌丝生长时间[16].

2.2.2 生物学效率对比

按表1培养基配方准确称取黑木耳菌糠培养基中各原料，混合后加水(以紧握原料没有水滴下最为适宜)，搅拌均匀，待原材料充分吸水后等量装入17 cm×32 cm×0.005 cm聚丙烯塑料袋中，每袋干料约450 g，121 ℃、高压灭菌2.5 h.冷却至室温后，将菌袋取出置于无菌操作台中，紫外照射30 min，无菌环境下进行接种，将接种后的菌袋放于26 ℃、空气相对湿度55%～65%条件下避光培养，当菌丝全部满袋现蕾后，转移至温度25～28 ℃、空气相对湿度为80%～90%的出耳室内进行出耳管理.注意早晚各通风1次，每次约40 min，当耳片呈紫褐色，边缘卷起，直径达到10～14 cm时开始采耳，采收下来的子实体立即称重并计算生物学效率.

生物学效率=(子实体鲜质量/培养料干质量)×100%[17].

2.3 生殖生长培养基配方筛选

生殖生长基料经预处理后，按表1培养基配方称重，后续过程同2.2.2.

3 结果与分析

3.1 黑木耳菌糠与杂木屑、玉米芯营养成分对比

3.1.1 全碳、全氮质量分数对比

由表2可知，黑木耳菌糠全碳、全氮质量分数均高于杂木屑、玉米芯，且与其他2种原料有显著差异，说明黑木耳菌糠能够满足新河大SL205对碳源、氮源的需求.

表2 不同原料中全碳、全氮质量分数对比

3.1.2 粗灰分质量分数对比

表3 不同原料中粗灰分质量分数对比

3.1.3 粗纤维质量分数对比

由表4可知，杂木屑中粗纤维质量分数最高达55.68%，玉米芯中粗纤维的质量分数为55.56%，而黑木耳菌糠中粗纤维的质量分数只有30.13%，与杂木屑、玉米芯有显著性差异，所以在利用黑木耳菌糠的同时，需要添加一定比例的玉米芯和杂木屑，以补充黑木耳菌糠的不足.

表4 不同原料中粗纤维质量分数对比

3.2 不同配方下供试菌株菌丝生长情况

从表5可以看出，新河大SL205在添加不同比例黑木耳菌糠的培养基下，菌丝均可正常生长，但生长速率存在明显的差异，在配方A、B与CK下菌丝洁白浓密，生长旺盛.其中配方B的菌丝生长速度最快，达7.26 mm/d，与其他配方相比呈极显著性差异，因此使用配方B作为比较供试菌株新河大SL205和对照菌株生物学效率的配方.

表5 新河大SL205在不同黑木耳菌糠培养基中的菌丝长速

3.3 供试菌株与对照菌株在不同配方下生物学效率

由表6、7可以看出，同样使用配方B，供试菌株新河大SL205生物学效率最高达126.29%；对照菌株毛木耳3号的生物学效率最高达113.39 %，呈显著性差异.因此最终优化得到适宜生殖生长的培养基配方是：黑木耳菌糠50%(质量分数，下同)、杂木屑30%、玉米芯10%、麸皮8%、石灰2%；研究也可以确定黑木耳菌糠的添加，有利于提高生物学效率，经细胞工程育种得到的新河大SL205分解黑木耳菌糠能力优于出发菌株.

表6 新河大SL205在不同黑木耳菌糠培养基中的生物学效率

表7 对照菌株毛木耳3号在不同黑木耳菌糠培养基中的生物学效率

4 结论与讨论

研究确定了黑木耳菌糠可以作为毛木耳的主要生殖生长基料；细胞工程菌株新河大SL205与对照菌株相比对黑木耳菌糠更具有分解优势.通过新河大SL205在以黑木耳菌糠为主要基质的培养基配方上的菌丝长速与生物学效率的对比实验，得到适宜配方：黑木耳菌糠50%(质量分数，下同)，杂木屑30%，玉米芯10%，麸皮8%，石灰2%.

黑木耳菌糠的添加量在50%时，供试菌株与对照菌株生物学效率均达到最高，随着菌糠添加量逐渐增高，生物学效率反而逐渐降低，说明黑木耳菌糠的添加能够在一定范围内提高生物学效率.因此，黑木耳菌糠作为毛木耳新河大SL205主要生殖生长基料，可以实现黑木耳菌糠的循环再利用，从而推动木耳类产业绿色可持续发展.本项研究表明：利用毛木耳对河北省贫困地区黑木耳主产区菌糠的资源化开发，是产业扶贫、生态农业可以利用的技术途径之一.