黄顶菊入侵不同时间对土壤微生物功能的影响

王妍，杜鄂巍，蒙彦良，孙建茹，桑晓玲，张风娟

(河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002)

外来入侵植物对土壤微生物的影响及其反馈在其定植和扩散中起着重要作用[1].一方面，植物凋落物、根系分泌物等释放到土壤，提供了丰富碳源，从而改变了土壤微生物的结构和功能[2].如外来入侵植物银荆(AcaciadealbataLink)入侵南非后，通过凋落物输入碳和生物固氮等过程改变土壤养分，影响土壤微生物群落功能[3]；外来入侵植物北美矢车菊(CentaureacyanusL.)其根系通过分泌化感物质，从而影响了土壤微生物群落[4].另一方面，土壤微生物将难以吸收利用的营养元素分解，加快物质循环，有利于外来入侵植物的竞争生长[5-6].如葱芥(Alliariapetiolata)可以提高入侵地土壤氮、磷、钙等营养成分的含量，提高养分的吸收利用，形成对自身有利的土壤环境，实现成功入侵[7]；黄顶菊[Flaveriabidentis(L.) Kuntze]根系分泌物或根系周围的土壤微生物有能力将土壤中难溶性磷转化为可溶性磷[8].入侵植物对土壤微生物的影响在其竞争反馈中也发挥了重要的作用[9].于文清等[10]研究表明紫茎泽兰(EupatoriumadenophorumSpreng.)入侵改变了土壤微生物群落，阻碍了当地植物的发育，却提高了紫茎泽兰的竞争能力.研究表明外来入侵植物盐生草(HalogetonglomeratusL.)的土壤细菌功能多样性高于本地植物[11]；陈学林等[12]发现随着入侵程度的加剧, 改变了外来植物红毛草(Rhynchelytrumrepens)土壤固氮菌群，提高了土壤微生物群落的丰富度指数和多样性指数.由此可以看出外来入侵植物可以影响土壤微生物功能.但是这些研究都主要集中在外来植物入侵后同一时间点或不同入侵程度，没有考虑入侵时间对土壤微生物功能的持续作用.

入侵中国的恶性杂草黄顶菊[Flaveriabidentis(L.)Kunt]，原生长于南美洲巴西、阿根廷等国，随后因强大的繁殖能力、生态适应性和生长可塑性等自然原因和人为因素逐步扩散到其他地区.20世纪90年代末发现于中国天津,直至2018年，黄顶菊已入侵华北地区多地，发生面积超过2×104hm2，破坏了当地的植物多样性和粮食生产[13-14].近年来有研究表明黄顶菊改变了入侵地土壤中微生物群落的结构，影响了土壤中与养分代谢相关的功能群落[15].如纪巧凤[16]研究表明黄顶菊改变了入侵地土壤磷细菌群落，丰富了群落多样性，优势菌群更加突出；Chen等[17]发现黄顶菊入侵的土壤中氮库增加，磷库尤其是有效磷减少.也有一些学者发现黄顶菊入侵地养分的改变与土壤微生物群落功能变化密切相关.如赵晓红[18]发现黄顶菊入侵后能通过改变根际土壤微生物的多样性来提高对营养成分的吸收利用.而目前学者发现，随着外来植物入侵时间发生变化，也改变了根际土壤微生物群落.如长兴县不同种植时间下毛竹林(Phyllostachysedulis)土壤化学性质发生了变化，而随着毛竹种植时间的延长，也影响了土壤中细菌群落结构[19].但有关外来植物在不同定植时间下对土壤微生物功能的影响缺少相关报道.因此，本研究利用同质园试验，选用黄顶菊及其常见伴生植物狗尾草为实验材料，研究分析不同定植时间植物根际土壤微生物对碳源的利用及功能多样性的影响，探究外来入侵植物根际土壤微生物功能随时间变化的规律，有助于进一步揭示外来植物的入侵机制.

1 材料与方法

1.1 试验样地

同质园位于中国农业科学院廊坊科研中试基地，气候适宜植物生长，土壤类型为棕色砂质黏壤土.2010年10月设立同质园小区(4 m×3 m)，小区间设置1 m宽的隔离带.共设黄顶菊单一种植小区(简称F)、本地植物狗尾草单一种植小区(简称S)和黄顶菊与本地植物混合种植小区(简称F+S)3个处理，同时设有空白对照(简称CK)，每个处理6个重复，5月中旬进行播种，6月中旬间苗至每小区36棵植株，混种小区混种比例为1∶1.

1.2 根际土样的采集和保存

分别于2014年10月、2016年10月和2018年10月收集样地土样，分别代表黄顶菊入侵后定植5年、7年、9年的土壤.在每个样地中按对角线采集法随机挑选发育比较好的5株植株的根际土壤，混合，并将混合后的土样过直径2 mm筛装袋标记，保存在-20 ℃冰箱中，备用.

1.3 Biolog测定

在超净工作台中用天平称量10 g土样置于无菌的250 mL锥形瓶中，加9 g/L的NaCl无菌水90 mL，用封口膜封口，用振荡培养箱120 r/min培养0.5 h，取出后静置3～5 min.取上清液5 mL于锥形瓶中，用无菌水稀释1 000倍，静置10 min后，用移液枪吸取150 μL稀释溶液置于生态板孔，于28 ℃培养箱中黑暗培养10 d.每隔1 d在全波长扫描酶标仪上在590 nm和750 nm处测得吸光值.

1.4 数据处理与分析

用Excel 2013软件统计数据作图，用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析.

测定每个ECO板的平均颜色变化(average well color development，AWCD)，计算公式为

AWCD=∑[(C590-R590)-(C750-R750)]/31，

物种丰富度指数(H)计算公式为H=-∑Pi(lnPi)，

Pi计算公式为Pi=(Ci-Ri)/∑(Ci-Ri)，

Simpson优势度指数(D)计算公式为D=1-∑Pi×Pi，

式中,Ci表示第i个ECO板孔的吸光值，Ri表示第i个对照孔的吸光值，ni表示第i个孔，Pi表示第i个孔吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率.

2 结果与分析

2.1 根际土壤微生物群落AWCD的动态变化

对定植不同时间(5年、7年、9年)黄顶菊和狗尾草根际土壤微生物进行培养，从培养开始计时，每隔1 d测定Biolog-ECO板的AWCD值，得到的动态变化如图1～3所示.由图1可知，在1 d之前，4种植被类型的AWCD值都很低，随着培养时间的延长，AWCD值逐渐增大.CK处理的AWCD值最低，F+S处理的AWCD值最高，而F和S处理的AWCD值处于中间且依次增大.由图2可以看出， CK处理最低，F处理次之，培养前5 d 的F+S处理的AWCD值高于S处理，5 d后F+S处理的AWCD值低于S处理.图3显示：CK处理的AWCD值最低，F+S处理的AWCD值最高，S处理和F处理的AWCD值依次增大.

图1 定植5年不同处理土壤AWCDFig.1 AWCD of soil in different treatment at 5 years of colonization

图2 定植7年不同处理土壤AWCDFig.2 AWCD of soil in different treatment at 7 years of colonization

图3 定植9年不同处理土壤AWCDFig.3 AWCD of soil in different treatment at 9 years of colonization

总之，F+S处理利用碳源能力最高，说明黄顶菊与狗尾草的竞争生长对土壤微生物的代谢活性起促进作用.

2.2 根际土壤微生物群落功能的多样性指数分析

选取培养第8天的数据分析黄顶菊不同定植时间不同植物处理下的土壤微生物功能多样性指数(表1).定植5年，丰富度指数H在这几个处理之间无显著差异，S处理的优势度指数D显著高于F处理，F处理和F+S处理的均匀度指数U显著高于其他处理.定植7年，S处理的H值显著高于CK处理和F处理，CK处理的D值显著小于其他处理，F处理和F+S处理的U值显著高于其他处理.定植9年，CK处理的H值和D值显著小于其他处理，F+S和S处理的U值显著高于其他处理.

3个年份中F+S处理的H值没有显著差异，定植9年 F处理的D值显著高于其他年份.F+S处理和S处理的U值定植9年显著高于其他年份.F处理的U值随着定植时间增加而减少，定植9年显著低于S处理.

总之，该结果说明黄顶菊单种处理中，土壤微生物功能多样性随定植时间的增加而降低.而在黄顶菊与狗尾草混种中，土壤微生物功能多样性随定植时间的增加而增加.

表1 定植不同时间不同处理土壤微生物群落的多样性分析(n=3)

不同大写字母代表定植不同时间之间在P<0.05水平上存在显著差异，不同小写字母代表同一定植时间不同处理之间在P<0.05水平上存在显著差异.下同.

2.3 根际土壤微生物对4类碳源的利用

选取第8天的数据分析土壤微生物利用4类碳源的能力(图4).微生物对脂类、氨基酸类和糖类利用较多，而对其他碳源的利用较少.定植5年F处理的土壤微生物对脂类的利用能力高于其他处理；F+S处理的土壤微生物对糖类、氨基酸和其他碳源的利用能力显著高于其他处理.定植7年F+S处理和S处理的土壤微生物对脂类的利用能力显著高于其他处理；F+S处理的土壤微生物对糖类和其他碳源的利用能力显著高于其他处理；F+S处理的土壤微生物对氨基酸的利用能力显著高于CK处理和F处理.定植9年S处理的土壤微生物对脂类的利用显著高于其他处理；F+S处理和S处理的土壤微生物对氨基酸的利用显著高于其他处理.

定植5年CK处理的土壤微生物对这4类碳源的利用能力都显著高于定植9年的.定植9年F+S处理、F处理和S处理的土壤微生物对脂类的利用显著高于定植5年的.定植5年F处理和F+S处理的土壤微生物对糖类的利用显著高于定植9年的.定植9年F处理的土壤微生物对其他碳源的利用在显著高于其他年份.

总之，与其他处理相比，F+S处理促进了土壤微生物对脂类、糖类和氨基酸的吸收，与其他定植年份相比，定植9年F+S处理的土壤微生物对脂类的利用能力显著提高，对糖类利用能力显著降低.

a.脂类;b.糖类;c.氨基酸;d.其他碳源.图4 定植不同时间不同处理根际土壤微生物群落对4类碳源的利用情况Fig.4 Utilization of four carbon sources in rhizosphere soil microbial communities treated with different colonization time

3 讨论

黄顶菊与狗尾草竞争生长提高了土壤微生物的代谢活性.本文结果显示，定植5年AWCD变化规律为F+S处理>F处理>S处理>CK处理；定植7年AWCD变化规律为S处理>F+S处理>F处理>CK处理；定植9年AWCD变化规律为F+S处理>S处理>F处理>CK处理.总之，这3个年份AWCD变化规律都是F+S处理>F处理.较高的AWCD值说明土壤微生物群落存在较高的代谢活性[20].表明黄顶菊与狗尾草混种土壤中微生物类群的代谢活性较旺盛.赵紫檀等[21]研究发现红树林-互花米草混种土地的微生物功能多样性和丰富度都要高于红树林单种群落和互花米草单种群落.侯晓杰等[22]的研究表明土壤有机碳、土壤碳氮比对土壤微生物的代谢活性影响较大.具有高代谢能力的土壤微生物对土壤中有机质的利用增加[23]，驱动有机物的循环，并通过固定和矿化反应调节植物养分的供应[24]，进而促进入侵植物生长和扩散[25].推测黄顶菊与狗尾草竞争生长通过促进土壤微生物的代谢活性，提高对养分的利用吸收，从而实现成功入侵.

外来植物改变了入侵地的土壤微生物群落功能多样性.丰富度指数H反映微生物群落多样性，H值越高，其物种数量越多、分布越均匀.将丰富度指数H应用于Biolog-ECO板时，微生物能够利用的碳源种类越多，H值越大.本研究结果表明定植7年和9年的3个处理的丰富度指数均大于空白处理，而3个处理之间没有差异性.说明黄顶菊入侵后没有改变土壤微生物的丰富度.优势度指数D可以反映微生物群落优势度，D值越大，群落常见物种优势度越高，代表多样性程度越低[26].将优势度指数D应用于Biolog-ECO板，D值较高表示微生物能够利用的碳源种类较单一，而D值越低则表示微生物能够利用的碳源种类越多.由结果可知，随着入侵时间的增加，F处理优势度指数D显著增加.说明黄顶菊长期定植后优势土壤微生物种群种类集中，数量较大.表明随着黄顶菊入侵时间的增加，入侵地土壤微生物功能的多样性降低.均匀度指数U反映物种的变化度和差异度.群落的物种数越多、均匀度越高，U值越大.将均匀度指数U应用于Biolog-ECO板，微生物能够利用的碳源种类越多样，U值越高.结果显示，3个年份的F+S处理的均匀度指数U均高于F处理，并且在定植9年时显著高于另2个年份.说明在F+S处理的土壤微生物群落分布更均匀，能够利用的碳源种类更多样.表明黄顶菊与狗尾草竞争生长的土壤微生物功能多样性最高，并且这种多样性与入侵时间呈正比.而F处理定植5年和7年均匀度指数U显著高于S处理，然而随着入侵时间的增加，均匀度指数U却呈现下降趋势，并在定植9年时显著低于S处理.说明入侵时间越长黄顶菊单种的土壤微生物均匀度越差.表明随入侵时间的增加，黄顶菊入侵降低了土壤微生物功能的多样性.综合3个多样性指数，表明黄顶菊入侵后土壤微生物功能多样性随入侵时间的增加而降低.而在黄顶菊与狗尾草竞争生长时，提高了土壤微生物功能多样性，并且随入侵时间的增加而增加.Huangfu等[27]研究表明黄顶菊入侵显著降低了土壤细菌群落的多样性，其含量的下降与入侵程度呈正相关.入侵植物通过影响土壤微生物群落结构和功能，打破了本地植物与微生物群落之间平衡共生的关系，影响当地物种发育，从而促进自身生长[28].牛红榜等[29]表明紫茎泽兰入侵后土壤微生物多样性增加，与养分代谢有关的微生物的数量也明显增多.区余端等[30]对土壤微生物功能多样性与土壤养分之间关系的研究表明：土壤有机碳和全氮含量与土壤微生物群落功能多样性呈显著正相关.因此，外来植物聚集优势微生物，改变其功能多样性，获得偏利生长，实现成功入侵.但是具体的这种微生物有利反馈途径有待进一步的研究.有学者发现入侵历史较长的土壤微生物生物量和活性均高于入侵历史较短的土壤[31]，土壤微生物可能会逐渐适应土壤环境并积累，但是积累到一定程度后也会发生降解.因此可以解释土壤微生物功能多样性指数随入侵时间的变化而改变.宋振等[32]等研究发现黄顶菊入侵后细菌多样性升高，群落结构更加复杂.这与本文结论不一致.推测由于他采用的是原生生态系统的土壤样品，许多非生物环境因素的影响不可控制，因此本文采取同质园试验，可以排除环境因素的干扰.

Biolog-ECO微平板的31种碳源可根据官能团不同分成脂类、糖类、氨基酸类和其他四大类别.本文研究表明，与其他处理相比，F+S处理促进了土壤微生物对脂类、糖类和氨基酸的吸收，与其他入侵年份相比，定植9年F+S处理土壤微生物对脂类的利用能力显著增高，对糖类利用能力显著降低.定植5年与7年之间无显著差异.赵晓红等[33]也发现黄顶菊入侵后显著提高了对糖类、氨基酸类、羧酸类和聚合物的利用.糖类、氨基酸类和脂类是植物根系分泌物的主要成分，而不同植物物种根系分泌物的量与组成成分不同，被微生物利用程度也不同，根系周转速率通常存在差异[34].因此黄顶菊入侵后会影响根系对土壤物质的运输，从而改变土壤微生物群落功能.并且有研究表明，随着入侵时间的延长，外来植物根系分泌的次生代谢物质是可以累积的[35].然而当各种代谢产物积累到一定量后, 土壤微生物会降解这些化感物质[36]，从而减弱土壤微生物对碳源的利用能力.因此，本地与外来植物土壤微生物利用碳源成分存在差异，它们之间的竞争生长促进了糖类、氨基酸类和脂类的吸收.而不同的入侵时间对各种碳源的影响有所不同.有关入侵时间对于不同碳源的利用机制还需进一步探究.

综上，黄顶菊的入侵改变了土壤微生物的功能，黄顶菊与狗尾草混种处理土壤微生物代谢活性高于黄顶菊单种处理，且混种处理土壤微生物均匀度指数均高于其他处理.随着入侵时间的延长，土壤微生物功能多样性的变化与种植方式有关：黄顶菊单种处理土壤微生物功能多样性随入侵时间的延长而降低，而黄顶菊与狗尾草混种处理土壤微生物功能多样性随入侵时间的延长而增加.