L- 精氨酸基姜黄素衍生物的合成及抑菌性评价

2021-04-27李海鹰邱明恒陈健王桂静杨文智

河北大学学报（自然科学版） 2021年2期

李海鹰，邱明恒，陈健，王桂静，杨文智

(河北大学药学院，生命科学与绿色发展研究院，河北保定 071002)

姜黄素(Cur，1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮)，存在于姜科和天南星科植物根茎中，经提取并精制可获其橘黄色粉末.姜黄素具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和抗类风湿等天然活性，一些活性研究已进入临床阶段，该化合物收载于《中华人民共和国药典》，世界卫生组织和FDA批准其为天然食品添加剂[1-2].其中，姜黄素在肿瘤预防方面的研究成为热点，美国国立肿瘤所已将其列为第3代癌化学预防药[3].姜黄素水中溶解度仅11 ng/mL，体内利用率低，限制其在临床应用[4].目前，研究者主要采用2种方案改善姜黄素溶解度和提高其稳定性.其一，采用新型药物制剂递送方法，改善姜黄素溶解度并获得良好的体内生物利用度[5]；其二，采用化学方法修饰姜黄素，获得其前体药物，以期获得一系列具有开发价值、具备良好药动学特性和生物活性的新型姜黄素衍生物[6].此外，琥珀酸和体内必需精氨酸，均属于机体内源性物质，参与机体代谢且具有良好水溶性[7].本文参照课题组常用的酯化条件[8-9]，以琥珀酸为连接臂，制备改善姜黄素溶解性的精氨酸基姜黄素衍生物，并评价其抑菌性能.

1 实验部分

1.1 仪器与试药

ZF-1三用紫外分析仪(上海驰唐实业有限公司)；T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；FT-IR 8400S傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津仪器公司)；AVANCEⅢ 600 Hz核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)；DSC-60 Plus差示扫描量热仪(日本岛津仪器公司)；Synergy HT酶标仪(美国伯腾仪器有限公司).

姜黄素、L-精氨酸、琥珀酸酐、EDC·HCl、DMAP均购于国药集团化学试剂有限公司；酵母粉购自北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白胨购自北京双旋微生物培养基制品厂；琼脂购自天津市科密欧化学试剂有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 Cur-Sa-Arg的制备

琥珀酸姜黄素(Cur-Sa)的制备：取姜黄素0.494 5 g(1.34 mmol)溶于25 mL二氯甲烷中，分别加入EDC 0.249 2 g(1.3 mmol)和0.037 6 g DMAP，35 ℃恒温水浴搅拌活化1.5 h，然后加入琥珀酸酐0.163 4 g(1.62 mmol)，反应48 h，减压蒸馏，取20 mL乙酸乙酯复溶，饱和食盐水洗涤3次.柱层析分离纯化得黄色产物，产量0.262 2 g，产率42%.

L-精氨酸甲酯的制备：-10 ℃下将6.56 g(55.07 mmol)二氯亚砜滴加到20 mL甲醇，加入L-精氨酸4 g(23.0 mmol)，35 ℃搅拌过夜，减压蒸馏除去溶剂，加入30 mL乙醚在-20 ℃重结晶，结晶真空干燥，产量4.26 g，产率98%.

L-精氨酸基姜黄素(Cur-Sa-Arg)的制备：取琥珀酸姜黄素(Cur-Sa)0.224 7 g(0.48 mmol)，溶于30 mL二氯甲烷中，分别加入EDC 0.092 6 g(0.48 mmol)和DMAP 0.012 7 g(0.096 mmol)，于35 ℃恒温水浴反应2 h，加入L-精氨酸甲酯0.112 8 g(0.60 mmol)，反应48 h，减压蒸馏，20 mL乙酸乙酯复溶，饱和食盐水洗涤3次，柱层析分离得红褐色产物，产量0.102 5 g，产率33%.Cur-Sa-Arg的合成过程见图1.

图1 L-精氨酸基姜黄素合成路线Fig.1 Synthetic route of Cur-Sa-Arg

1.2.2 Cur-Sa-Arg的表征

UV-Vis分析：样品用四氢呋喃溶解，四氢呋喃为空白，在190～600 nm波长处进行扫描.

FT-IR分析：样品溴化钾压片，在波长240～4 500 cm-1扫描，分辨率为2 cm-1，扫描50次.

1H NMR分析：样品溶于氘代DMSO，置于AVANCE Ⅲ(600 MHz)核磁共振波谱仪中检测.

DSC分析：样品置于差示扫描量热分析仪中检测，升温速度10 ℃ /min，起始温度50 ℃，截止温度为300 ℃，N2气流保护，流速为50 mL/min.

1.2.3 Cur-Sa-Arg溶解度测定

精密称取20 mg姜黄素，无水乙醇定容至10 mL容量瓶中，分别移取姜黄素溶液5、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μL置于10 mL容量瓶，无水乙醇定容得姜黄素溶液质量浓度分别为1、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 μg/mL.在紫外可见分光光度计190～600 nm处波长扫描，确定姜黄素最大吸收波长为424 nm，在此波长处测定配制姜黄素溶液的吸光度.将Cur-Sa-Arg饱和水溶液，超声30 min，12 000 r/min高速离心10 min，取上清液200 μL，无水乙醇定容至10 mL，得待测样品溶液备用[7].以质量浓度x(μg/mL)对吸光度y作图，得标准方程为y=0.129 5x+0.065，R=0.995 4.测定Cur-Sa-Arg样品中姜黄素吸光度，代入标准曲线公式，计算Cur-Sa-Arg含量，乘上相应稀释倍数得其水中溶解度.

1.2.4 抑菌评价

选择常见敏感菌株大肠杆菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、鼠沙门氏菌(Salmonellaratus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)来验证Cur-Sa-Arg化合物抑菌效果.

LB液体培养基配置：按胰蛋白胨∶酵母粉∶氯化钠=2∶1∶2(质量比)加入去离子水摇匀，胰蛋白胨质量分数为1%，调节pH为7.2～7.4，121 ℃下高压蒸气灭菌25 min，备用.

药液配置：精密称取25 mg Cur和Cur-Sa-Arg分别溶于0.5 mL DMSO中，充分溶解摇匀，得到50 mg/mL的药物储备液.精密量取储备液100 μL，加蒸馏水稀释至1 mL，充分摇匀，得其混悬液[10]，备用.

菌悬液制备：采用固体斜面活化法传代2次后，用灭菌PBS pH 7.4 磷酸缓冲液3～4 mL反复冲洗固体培养基表面菌株，收集洗液离心，倒掉上清液，保留底部菌沉淀，加无菌缓冲液稀释至1×105CFU/mL摇匀，备用.

抑菌评价：采用微量二倍稀释法，在96孔板每个孔中均加入100 μL灭菌LB液体培养基.测试组：第1孔加入100 μL药物混悬液，反复吹吸混合均匀后，吸取100 μL加入到第2孔，以此类推稀释至第9孔时吸取100 μL打掉，最后加入100 μL菌液；对照组：第1孔加入100 μL空白溶剂，反复吹吸混合均匀后，吸取100 μL加入到第2孔，以此类推稀释至第9孔时吸取100 μL打掉，最后加入100 μL菌液；空白组：加入100 μL无菌缓冲液.每组重复3次.在600 nm处，用酶标仪测定OD值，37 ℃下静置培养18 h，测定OD值.抑菌率计算公式如式1所示，求得Cur-Sa-Arg和Cur的半数抑菌浓度IC50(μg/mL).

抑菌率=(ODR-OD)/(ODR-ODB)×100%,

(1)

其中，OD为实验组测定孔的吸光值；ODR对照组孔的吸光值；ODB为空白组孔的吸光值.

2 结果与讨论

2.1 Cur-Sa-Arg的制备及表征

本研究以琥珀酸作连接臂，通过酯化和酰化反应，将精氨酸键接到姜黄素上，获得L-精氨酸基姜黄素(Cur-Sa-Arg)化合物.产物经UV-Vis、FT-IR、1H NMR和DSC表征，证明成功合成.

图2为反应物与产物的紫外可见光谱图.姜黄素溶液(图2a)最大吸收峰出现在421 nm，琥珀酸酐溶液(图2b)仅在239 nm处有强吸收峰，而合成的琥珀酸姜黄素化合物(图2c)最大吸收峰红移至410 nm，表明琥珀酸酐酯化姜黄素分子上的羟基生成单琥珀酸姜黄素，琥珀酸酐开环，其羧基与姜黄素羟基成酯.姜黄素分子中提供孤对电子的氧原子与琥珀酸羰基形成P-π共轭，羰基吸电子效应使姜黄素共轭体系电子云密度降低，吸收峰发生红移[11].此外，琥珀酸酐开环形成琥珀酰二羧酸，酸酐开环共轭效应减小，使得电子跃迁需要高能量，导致紫外最大吸收峰蓝移至253 nm处.上述变化证明Cur-Sa的成功合成.L-精氨酸甲酯(图2d)紫外最大吸收峰出现在280 nm处，而姜黄素在280 nm处无紫外吸收峰.L-精氨酸基姜黄素(图2e)在281 nm处有强的紫外吸收峰，推测生成Cur-Sa-Arg产物.

反应物及产物的红外图谱见图3.姜黄素(图3a)在3 454 cm-1处出现酚羟基的伸缩振动吸收，1 629和1 506 cm-1处出现苯环CH和C=C的振动吸收峰[12].琥珀酸酐(图3b)在2 974 cm-1处出现亚甲基C—H的伸缩振动峰，1 760 cm-1处为环内酯羰基C=O的伸缩振动峰[13].L-精氨酸(图3c)富含氨基、羟基和胍基，故3 000～3 400 cm-1处出现强红外吸收峰，1 681 cm-1处为酰胺C=O峰，1 620 cm-1处为羧基C=O吸收峰，胍基的弯曲振动吸收在1 544 cm-1处[14].相比姜黄素，琥珀酸姜黄素游离出单羧基，在3 436 cm-1处的吸收峰变强；1 695 cm-1处酯键伸缩振动吸收峰以及2 916与2 842 cm-1的亚甲基和次甲基伸缩振动吸收峰明显变强[14]，显示成功合成琥珀酸姜黄素(图3d).与L-精氨酸相比，L-精氨酸甲酯(图3e)的酯羰基峰出现在1 743 cm-1处，而1 620 cm-1处的羧基羰基吸收峰消失，可证明L-精氨酸甲酯合成.与琥珀酸姜黄素(图3d)相比，L-精氨酸基姜黄素形成酰胺键，游离羧基消失，故在3 436 cm-1处吸收峰强度改变，3 070 cm-1处新出现胍基峰，1 749 cm-1处出现L-精氨酸甲酯的酯羰基峰，1 568 cm-1出现强酰胺Ⅱ带吸收峰(图3f).

a. 姜黄素；b. 琥珀酸酐；c. 琥珀酸姜黄素；d. L-精氨酸甲酯；e. L-精氨酸基姜黄素.图2 样品紫外-可见光谱Fig.2 UV-Vis spectra of samples

a. 姜黄素；b. 琥珀酸酐；c. L-精氨酸；d. 琥珀酸姜黄素；e. L-精氨酸甲酯；f. L-精氨酸基姜黄素.图3 样品红外光谱Fig.3 FTIR spectra of samples

样品的1H NMR图谱(600 MHz，DMSO-d6)见图4.姜黄素(图4a)中9.78为酚羟基的质子峰，6.84～7.64归属于苯环质子峰，3.63为环上甲氧基质子峰[15].与姜黄素相比，琥珀酸姜黄素(图4b)中的琥珀酸的2个—CH2—质子峰出现在2.42～2.54；此外，12.1处新出现的峰为琥珀酸酐键接姜黄素羟基后游离出的单羧基质子峰[16]，证明单琥珀酸姜黄素成功合成.L-精氨酸甲酯(图4c)氨基和胍基质子峰出现在8.69、8.50、7.99、7.89，甲氧基质子峰出现在3.75，氨基酸碳链在1.49～4.06出现多重质子峰[17].L-精氨酸基姜黄素(图4d)中6.74～7.55归属为苯环质子峰，3.62为甲氧基质子峰，在2.41～2.70出现琥珀酸连接臂的2个—CH2—质子峰，3.15～3.83处出现精氨酸甲酯—OCH3质子峰，胍基和氨基质子峰出现在8.21～8.62.上述1H NMR图谱数据显示单琥珀酸姜黄素成功连接精氨酸甲酯.

主要原料及产物的差示扫描量热图(DSC)如图5所示.姜黄素粉末(图5a)的熔融吸热峰出现在183 ℃.琥珀酸酐(图5b)熔点吸热峰出现在125 ℃.L-精氨酸(图5c)分别在223、246 ℃处出现2个吸热峰，与文献报道一致[18].酯化合成的琥珀酸姜黄素(图5d)，在167 ℃出现单一熔点吸热峰，佐证琥珀酸姜黄素的合成.L-精氨酸甲酯(图5e)生成新酯键，其熔点吸热峰呈现在193 ℃.L-精氨酸基姜黄素(图5f)新形成的酰胺键，在232 ℃时出现新熔点吸热峰.