Quaterrylene-环糊精肿瘤光热治疗剂的大鼠肾-尿代谢研究

李金梅，罗亚丽，王克让

(1. 保定市第一中心医院 病理科，河北 保定 071000；2. 河北大学 化学与环境科学学院，药物化学与分子诊断教育部重点实验室，河北 保定 071002)

恶性肿瘤严重威胁着人们健康. 根据最新统计结果，全球每年新增肿瘤患者约1 810万人，每年约960万人死于恶性肿瘤，而中国新增患者约380.4万，死亡患者约229.6万[1]. 光热治疗(photothermal therapy, PTT)是将光能转化为热能而达到治疗效果的一种新的治疗手段，具有组织穿透性深、灵敏度高、全身毒性低、精确可控性高,以及无创性或微创性等优点，在癌症治疗方面具有重要应用[2]. 目前，广泛研究的光热治疗剂主要包括：无机纳米材料[2]、碳纳米材料[3]、有机聚合物[4]和有机小分子[5]等. 每种光热治疗剂都有其自身固有的特殊理化性质，具有各自的优点和局限性.

根据美国食品和药品管理局(FDA)规定所有注射药物分子应在一定的时间从体内完全清除[7]. 肿瘤光热治疗剂作为诊疗一体化分子，代谢问题是限制其临床应用研究的关键科学问题之一. 药物代谢的主要途径是肝脾代谢和肾代谢. 药物的肾-尿代谢与肝脾代谢相比，具有代谢时间短、对机体其他器官损伤小和潜在的长期毒副作用低等优点[8]. 因此，发展肾-尿代谢型光热治疗剂在肿瘤光热治疗方面具有重要意义.

最近，笔者设计合成了环糊精修饰的quaterrylene衍生物(QDI-CD，图1)，其在体外和体内具有良好的光热治疗作用，光热转化效率达62.53%. 另外，代谢研究发现QDI-CD在昆明鼠体内的肾-尿代谢率可达(67.00±2.37)%，并且治疗组和空白组的肾脏病理显示其对肾脏没有损伤(图1)[9]. 与昆明鼠相比，SD大鼠的体质量约为200 g，是昆明鼠体质量(50 g)的4倍. 另外，腹腔注射和尾静脉注射是药物研究主要的给药方式，SD大鼠体质量大，更有利于研究腹腔注射给药对药物代谢的影响[10-11]. 因此，笔者研究了QDI-CD在SD大鼠体内的代谢情况，发现QDI-CD具有好的肾-尿代谢率，并且代谢前后QDI-CD的结构没有改变.

图1 环糊精修饰quaterrylene衍生物QDI-CD的结构(a)，以及光热治疗(b)和空白组(c)的肾脏病理图[9]Fig.1 Structure of cyclodextrin modified quaterrylene derivative (QDI-CD)(a), Hematoxylin and eosin (H&E)-stained histological sections of kidney obtained from mice in the PTT group (b) and control group (c)

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高分辨质谱仪：FT-MALDI MS (布鲁克公司)；紫外-可见分光光度计：Cary 5000 (安捷伦科技有限公司)；小鼠代谢笼；常用有机溶剂为分析纯.

1.2 实验方法

1.2.1 SD大鼠尿液收集

4只SD大鼠，体质量为200 g/只，随机分为4组，放在代谢笼中，分为实验组1、实验组2、实验组3和空白组. 代谢实验前，SD大鼠禁食12 h. 将1 mL质量浓度为1 mg/mL的QDI-CD光热治疗剂腹腔注射到SD大鼠体内，空白组腹腔注射1 mL的PBS缓冲溶液，在代谢笼内分别收集SD大鼠12 h和24 h的尿液.

1.2.2 SD大鼠尿液处理及测试

将收集的SD大鼠不同代谢时间的尿液用去离子水稀释到合适质量浓度，尿液12 000 r/min离心5 min，取上层清液，在紫外-可见分光光度计上测试其紫外吸收特征.

1.2.3 尿液的高分辨质谱分析

将收集的SD大鼠的尿液用二氯甲烷萃取3次，将二氯甲烷相合并，浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱剂为V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1. 分离纯化后的尿液代谢物经高分辨质谱分析.

2 结果与讨论

2.1 SD大鼠尿液的紫外-可见光谱分析及代谢率

按1.2.1小节操作收集尿样.如表1所示，腹腔注射12 h后，实验组1～3收集的尿液分别为9.9、6.1和5.1 mL. 腹腔注射24 h后，实验组1～3收集的尿液分别为6.2、7.3、6.8 mL. 基于QDI-CD分子在600～1 000 nm内具有紫外-可见特征吸收峰，而尿液中的代谢物在这一吸收区间没有干扰，因此，通过紫外-可见分光光度计测试了代谢尿液的紫外-可见吸收峰.

表1 实验组SD大鼠在12 h和24 h的尿液体积

由于SD大鼠的代谢尿液量不同，导致QDI-CD含量不同，实验组2和实验组3的QDI-CD的特征吸收峰超出紫外-可见分光光度计的测试量程，因此，将实验组2和实验组3的12 h和24 h代谢尿液用去离子水分别稀释5倍到30.5 mL/36.5 mL和25.5 mL/34.0 mL. 如图2实验组1-3在600～1 000 nm内有QDI-CD的特征吸收峰，最大吸收峰处的吸光强度分别为0.551 659、0.190 959、0.328 329. 根据朗伯比尔定律，经折算尿液中QDI-CD的质量分别为0.406 2、0.433 2、0.622 8 mg. 因此，QDI-CD光热治疗剂在每组SD大鼠的肾-尿代谢率分别为40.62%、43.32%、62.28%. 3组实验组的QDI-CD光热治疗剂的平均肾-尿率达到48.74%. 研究结果表明，无论是体质量为50 g的昆明鼠，还是体质量达到200 g的SD大鼠，QDI-CD都有较高的肾-尿代谢率. 另外，QDI-CD腹腔注射24 h后，SD大鼠的代谢尿液中没有QDI-CD的特征吸收峰，说明腹腔注射12 h后，QDI-CD已基本代谢完全. 这些研究结果说明QDI-CD在SD大鼠体内能快速代谢.

图2 腹腔注射12 h后，QDI-CD(1 mL, 1 mg/mL)的肾-尿代谢的尿液的紫外-可见吸收光谱(a)，药物注射12 h和24 h后，不同实验组的平均肾-尿代谢率(b)Fig.2 UV-Vis spectra of urines for the SD rats after injection of PBS and QDI-CD group 1, QDI-CD group 2 and QDI-CD group 3 at 12 h (a), and the renal clearance efficiencies at 12 and 24 h, respectively(b)

2.2 QDI-CD代谢后的高分辨质谱

代谢前后药物分子结构的稳定性是评价药物临床应用的重要指标之一. 鉴于QDI-CD具有好的肿瘤光热治疗效果[9]和好的肾-尿代谢过程，进一步研究了QDI-CD在大鼠体内代谢前后的结构稳定性. 腹腔注射1 mL的QDI-CD(1 mg/mL)，收集SD大鼠12 h内的尿液. 由于尿液中的成分比较复杂，为了提高高分辨质谱测试的准确度，将SD大鼠的尿液做了分离. 由于环糊精分子的修饰，QDI-CD既能溶于水溶液，又能溶于常见的有机溶剂. 因此，用二氯甲烷萃取尿液，进而经柱层析分离纯化，再进行质谱分析. QDI-CD的结构式为C168H234N2O72，理论相对分子质量为3 432.474 4. 如图3所示，SD大鼠尿液的高分辨质谱为3 455.478 4，分析QDI-CD的结构特征，3 455.478 4的质谱峰为QDI-CD的[M+Na]+. QDI-CD的[M+Na]+的分子式为C168H234N2NaO72，相对分子质量为3 455.464 2，高分辨质谱图(图3)显示3 455.478 4. 研究结果说明QDI-CD肾-尿代谢前后分子结构没有改变，QDI-CD具有非常好的结构稳定性.

图3 QDI-CD腹腔注射12 h后，SD大鼠尿液的高分辨质谱(MALDI-TOF)Fig.3 MALDI-TOF spectrum of QDI-CD in urine samples from SD rats after 12 h of intraperitoneal injection

3 结论

研究了环糊精修饰quaterrylene衍生物QDI-CD在SD大鼠中的肾-尿代谢情况，发现腹腔注射1 mL的QDI-CD(1 mg/mL)12 h后，QDI-CD可代谢完全，平均肾-尿代谢率达到48.74%. 另外，通过高分辨质谱研究了SD大鼠代谢尿液中QDI-CD的结构特征，结果显示QDI-CD代谢前后分子结构没有发生改变，说明其具有良好的结构稳定性. 分析QDI-CD的结构特征可知，quaterrylene作为近红外吸收分子具有良好的结构稳定性[12]，全甲基化环糊精分子中羟基被甲氧基取代，不仅增强了水溶性，而且增强了结构稳定性[13]. 此外，环糊精类衍生物不仅具有良好的水溶性，而且作为肾-尿代谢促进分子广泛用于肾功能研究[14]. QDI-CD分子作为肾-尿代谢型有机光热治疗剂在肿瘤治疗方面具有潜在的应用价值.