白花泡桐二倍体和同源四倍体抗逆基因差异表达的研究

赵晓改，李冰冰，吕钰洁，徐赛赛，董洋，赵振利

(河南农业大学林学院，河南 郑州 450002)

在植物的生长过程中，不可避免地会遭受逆境胁迫[1]，而植物也在自然进化过程中通过改变自身的生物学和生态学特性来提高其抗逆性，从而保证植物的正常生长。多倍化是植物自然进化的主要驱动力之一[2]。植物多倍化后通过调控气孔变化、生物膜系统、细胞渗透调节系统、抗氧化系统、基因和蛋白质表达[3-8]等方面使其生态适应性和抗逆性显著增强，这些生物学特性变化在对西瓜[9]、小麦[10]、大豆[11]、水稻[12]、杨桃[13]和桑树[14]等多倍体植物的相关研究中得到了证实。泡桐在木材生产、改善生态环境和农田防护林方面具有显著作用[15]，目前在亚洲、欧洲、非洲、美洲和大洋洲的许多国家广泛引种[16-17]。植物的形成层具有很强的分化能力，向外形成韧皮部，在适应生物侵袭的防御能力和非生物胁迫中具有重要作用[18]，研究植物形成层和韧皮部的基因表达能有效筛选抗逆基因。ZHANG等[19]和XU等[20]的研究表明，四倍体泡桐在抗旱和抗盐等抗逆性方面均明显强于二倍体。本研究首次以大田8 a生白花泡桐二倍体和同源四倍体的形成层和韧皮部为材料，以白花泡桐基因组为参考序列，利用Illumina 高通量测序技术对白花泡桐二倍体和同源四倍体进行转录组测序，通过分析二者之间的基因表达变化情况，得到二者之间的抗逆基因，并将二、四倍体之间的差异基因进行GO (Gene Ontology) 功能和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 代谢途径富集分析，其结果将有助于提高对多倍体抗逆分子机制的认识，为进一步了解抗逆基因表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以河南农业大学许昌县泡桐试验基地8 a生的白花泡桐(Paulowniafortunei)二倍体(PF2)和同源四倍体(PF4)为试验材料，分别剥取距离地面1.5 m处泡桐树干的韧皮部和形成层，迅速放于液氮中，并于-80 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 文库构建以及高通量测序 RNA提取参照李小凡等[21]的方法进行，测序文库使用Illumina由文库试剂盒(NEBNext UltraTM RNA)生成。高通量测序参照李小凡等[21]的方法进行，每个样品重复3次。

1.2.2 质量控制 Clean reads(高质量读长)的获得参照李小凡等[21]方法进行，将clean reads比对到泡桐参考基因组序列上，进行clean reads的GC含量计算和Q30百分比比较以及序列重复水平。

1.2.3 基因功能注释 基因功能注释分别采用NCB非冗余蛋白序列(Nr)、蛋白家族(Pfam)、同源蛋白群簇(KOG/COG)、非冗余蛋白质序列数据库(Swiss-Prot)、KEGG以及GO，均参照DONG等[5]的方法。

1.2.4 可变剪切分析 使用分析软件ASprofile(Version:1.0)将预测的mRNA转录本事件分为12类：外显子可变剪切包括：第一个外显子(TSS)和最后一个外显子(TTS)；外显子跳跃包括：单外显子(SKIP)、模糊边界的单外显子(XSKIP)、多外显子(MSKIP)和模糊边界的多外显子(XMSKIP)；内含子包括：单内含子(IR)、模糊边界的单内含子(XIR)、多内含子(MIR)和模糊边界的多内含子(XMIR)；5′或3′端剪切包括可变(AE)和模糊边界的可变(XAE)。

1.2.5 差异基因的鉴定 FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)值作为mRNA的表达水平[22]。将log2(fold change)>2或<-2且P<0.05的基因选定为差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)[23]。

1.2.6 差异表达基因GO和KEGG通路富集分析 对DEGs进行GO [http://www.geneontology.org/] 富集分析，利用KEGG数据库[http://www.genome.ad.jp/kegg]进行通路富集分析并预测基因的潜在功能。

1.2.7 Quantitative Real-Time PCR 随机挑选8个差异表达基因进行Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR)验证。引物设计如表1所示，qRT-PCR操作方法参见LIU等[24]的方法。18S rRNA作为内参，数据处理采用2-△△Ct法[25]，每个样品重复3次。

表1 QRT-PCR验证6个转录本的引物序列Table 1 Primers for quantitative qRT-PCR analysis of 6 transcripts

1.2.8 泡桐与其他11个物种多酚氧化酶的系统进化树分析 其他11个物种的多酚氧化酶(PPO)的序列来源于NCBI。采用软件MEGA7.0对泡桐和其他11个物种的PPO蛋白序列进行进化树分析，PPO的序列进行对比，以构建Bootstrap值为1 000的Neighbor-Joining进化树。

2 结果与分析

2.1 白花泡桐二倍体和同源四倍体测序数据统计分析

从PF2和PF4 的mRNA文库中分别得到245 331 892和236 029 526 原始读长，去除低质量的读长，得到有效数据分别为122 665 946和118 014 763个，其中，Q30碱基比例分别为：92.94%～93.25%，92.80%～93.83%，GC 含量约为45.18%和45.61%(表2)。分别将PF2(PF2-1、PF2-2和PF2-3)和PF4(PF4-1、PF4-2和PF4-3)的clean reads与泡桐基因组序列进行比对，PF2比对效率为91.47%～91.79%，PF4为92.08%～92.50%(表3)。PF2和PF4转录组测序质量结果表明，插入片段在基因上的分布范围为50～800 bp(图1)，表明测序基因的片段长度较好，可以用于后续分析。

图1 插入片段长度模拟分布图Fig.1 Insert length simulation distribution graph

表2 测序数据统计分析Table 2 Statistical analysis of sequencing reads

表3 测序数据与泡桐参考基因组的序列比对Table 3 Sequencing data and Paulownia reference genome sequence alignment

2.2 白花泡桐二倍体和同源四倍体基因表达量分析

通过箱线图(图2)可以看出，基因表达水平在PF2-1、PF2-2、PF2-3和PF4-1、PF4-2、PF4-3的离散程度较好(图2-a)，能够用于后续试验。生物学重复如图2-b所示，可以看出，PF2-1、PF2-2、PF2-3和PF4-1、PF4-2、PF4-3皮尔逊相关系数为1，皮尔逊相关系数通常被用于生物学重复相关性的评估指标，说明生物学重复性好。

2.3 白花泡桐二倍体和同源四倍体可变剪切分析

在非生物和生物胁迫的响应中，可变剪切(AS)在基因表达过程中起显著作用[5]。本研究中，使用分析软件ASprofile(Version:1.0)将预测的mRNA转录本事件分为12类(表4)，在32 748个基因中鉴定出56 287个AS事件，其中，TSS是AS事件最多的，其次是TTS (表4)。PF2和PF4相比之下，PF4生成的AS异构体更多，可能在调控抗逆基因表达过程中具有重要的作用。

表4 基因可变剪接类型统计Table 4 Statistics of gene alternative splicing type

2.4 白花泡桐二倍体和同源四倍体基因注释及抗逆性相关差异基因

基于泡桐参考基因组序列，共发现前期未被注释的1 850个新基因的注释信息，其中，注释数量1 842(NR)、1 672(EggNOG)、1 240(Swiss-Prot)、1 184(GO)、1 149(Pfam)、1 054(KOG)、777(KEGG)和589 (COG)，从而进一步丰富泡桐基因组的注释(图3)。

(a)FPKM箱线图；(b) 重复相关性评估。(a) FPKM boxplot;(b) Repeated correlation assessments.图2 样品总体分布和重复相关性评估Fig.2 Evaluation of the overall distribution and repeated correlation of all the sample

图3 新基因功能注释结果统计Fig.3 New gene function annotation result statistics

根据差异基因标准，共获得3 138个(图4)差异基因，其中绿色代表1 209个下调差异基因，如与抗逆性有关的：水分通道蛋白(Aquaporin)、9-顺式-环氧类胡萝卜素加氧酶(NCED)、蛋白质S-酰基转移酶(S-AAT)和周期素依赖性激酶5(CDK5)。红色圆点代表1 929个上调差异基因，如：超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(14-3-3蛋白))、甜菜碱醛脱氢酶(BADH)和吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CRs)等与抗逆性有关的基因。

图4 PF2和PF4差异表达基因火山图Fig.4 Volcanic map of PF2 and PF4 differentially expressed genes

2.5 白花泡桐二倍体和同源四倍体差异基因qRT-PCR验证

为了验证RNA-seq数据的可靠性，随机选择8个DEGs，包括超氧化物歧化酶(Paulownia_CONTIG01571G000017)、多酚氧化酶(Paulownia_LG16G000444)、受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Paulownia_LG8G000614)、假设蛋白F511_21580(Paulownia_LG8G001775)、WD重复蛋白26(Paulownia_LG8G001915)、CDK5活化蛋白(Paulownia_CONTIG01571G000067)、蛋白质S-酰基转移酶 16(Paulownia_CONTIG01580G000123)和假设蛋白CDL12_29010(Paulownia_LG12G000316)利用qRT-PCR进行验证，结果表明，在PF2与PF4中，8个DEGs的相对表达量与测序结果趋势一致(图5)，说明本试验的转录组测序结果是准确的。

图5 PF2和PF4表达量qRT-PCR验证Fig.5 The expression levels of PF2 and PF4 verified by qRT-PCR

2.6 白花泡桐二倍体和同源四倍体差异基因功能分析

为了更好地理解3 138个DEG的功能和分类，运用GO和KEGG进行基因功能分析。KEGG代谢通路分析表明，差异基因共参与了116个KEGG通路(图6)。其中，植物激素信号转导(42)，碳代谢(37)，淀粉和蔗糖的代谢(33)，剪接体(32)等通路高度富集，表明抗逆性相关差异基因可能参与了激素信号转导。GO功能分析表明(图7)：在生物过程类别中，代谢(701)，细胞(277)和单组织过程(247)是最丰富的；在细胞成分分类中，以细胞(750)，细胞部分(721)和细胞膜(474)最为丰富；在分子功能分类中，最丰富的是催化活性(996)，结合(920)和运输活动(153)。

图6 差异表达基因KEGG通路富集散点图Fig.6 Rich distribution point diagram of differentially expressed gene KEGG pathway

图7 差异表达基因的GO注释分类统计Fig.7 GO annotation classification statistics of differentially expressed genes

2.7 泡桐抗逆性相关的基因PPO与其他物种的系统进化树分析

PPO作为ROS的清除剂，其活性高低是衡量植物抗逆性过程中的一些重要指标[27]。为了更深入的了解泡桐PPO的功能，泡桐和其他11个物种的PPO蛋白序列通过MEGA7.0用于进化树系统发育分析(图8)。分析结果发现，12个PPO蛋白序列被分为两个分支，泡桐的PPO序列与玄参科的独脚金和黄色猴面花，苦苣苔科的旋蒴苣苔和胡麻科芝麻的蛋白序列相似度达到78%以上，其中，泡桐与芝麻的同源性最高(88%)，与芝麻铜胁迫下PPO 活性都迅速得到提高结果一致[28]，研究结果表明，泡桐可能是通过PPO基因倍增和丢失的差异变化来响应逆境胁迫。

图8 12个物种的PPO蛋白序列系统进化树分析Fig.8 Phylogenetic tree analysis of PPO protein sequences of 12 species

3 结论与讨论

SOD直接参与活性氧的解毒过程中，可有效降低活性氧浓度，在维持细胞内氧化还原环境的稳态中起着至关重要的作用[29]。当植物遭受逆境时，过氧化氢(OH-)、单线态氧(1O2)、羟基自由基(-OH)和体内超氧根离子(O2—)等含量将会过度积累，与体内一些有机物发生反应而损伤细胞，造成DNA突变、蛋白质损伤、脂质过氧化和酶失活等毒害[30-31]，而SOD能够清除O2—形成H2O2和O2，进一步被过氧化氢酶催化生成H2O[32]，在过去的研究中，SOD活性常常可视为一个抗逆性指标[33]。在本研究中，SOD(Paulownia_CONTIG01571G000017)在PF4中比PF2的表达量明显升高，推测与PF2相比，PF4四倍体具有更强的清除活性氧能力。

PPO作为ROS的清除剂，可直接参与应激保护[27]。例如，在番茄中PPO活性的提高可以增强番茄对干旱的反应[34]。在马铃薯块茎和苹果芽的外植体中已成功转入外源PPO基因，显著提高了其抗病性[35]。因此，PPOs的活性高低是衡量植物抗逆性过程中的一些重要指标[27，36]。而在本研究中，利用高通量测序对白花泡桐二倍体和同源四倍体进行测序分析，鉴定白花泡桐同源四倍体中与抗逆相关基因，其中，PF4的PPO(Paulownia_LG16G000444)表达量明显高于PF2，推测PPOs在提高泡桐的抗逆性方面具有重要的作用。

14-3-3蛋白主要作为同源二聚体或异源二聚体存在于所有真核生物中，参与生物和非生物胁迫、细胞周期和生长调节等代谢和信号通路[37]。在已报道的研究中，发现过表达14-3-3蛋白时，棉花对干旱胁迫的耐受性增强[38]，这可能是通过14-3-3蛋白和H+-ATPase酶的复合物调控气孔。本研究中，PF4的14-3-3蛋白(Paulownia_LG11G000182)表达量明显高于PF2，推测这也可能是PF4抗逆性优于PF2的原因之一。

植物多倍化后，通过基因表达和表观遗传的相应变化来调控气孔大小、海绵组织的结构[3-4]、生物膜系统细胞渗透调节系统[5-6]和抗氧化系统[7-8]，从而增强自身的抗逆性。前人研究结果表明，多倍体植物对干旱、高温、低温、病害和盐胁迫等往往具有更强的抗性[12]。在建立PF2和PF4文库并进行高通量测序的基础上，本文开展了白花泡桐二倍体和同源四倍体抗逆基因差异研究，结果发现，PF4的SOD(Paulownia_CONTIG01571G000017)、PPO (Paulownia_LG16G000444) 和14-3-3蛋白(Paulownia_LG11G000182)表达量明显高于PF2，表明其可能在四倍体抗逆性机制中起重要调控作用。本研究筛选鉴定到了不同倍性白花泡桐中的抗逆相关基因并进行了功能分析，研究结果为揭示多倍体抗逆性的分子机制奠定了坚实基础。