RNA 药物的发展及其在水产上的应用

潘银来 邱春辉 王艺磊 张子平，5

（1. 大黄鱼育种国家重点实验室，宁德 352103；2. 福建农林大学动物科学学院，福州 350001；3. 福建农林大学生命科学学院，福州 350001；4. 集美大学水产学院，厦门 361021；5. 福建农林大学海洋研究院 福建省海洋生物技术重点实验室，福州 350001）

核酸药物是一类具有不同功能的DNA 或RNA，其具有特定的靶点和作用机制，通常在基因或其表达水平上发挥作用［1］。这些药物具有很高的特异性，可以靶向选定的基因、mRNA 和非编码RNA，而且副作用比传统的药物小［2］。一般包括核酸适配体（Aptamer）、抗基因（Antigene）、核酶（Ribozyme）、反 义 寡 核 苷 酸（Antisense oligonucleotide，ASO）、RNA 干扰剂等［3］。在过去的25 年里，用RNA 分子作为治疗药物从概念走向了临床。早期因为RNA 分子不稳定易被降解，在体内有相对较短的半衰期［4］，被认为其难以作为有效的治疗药物。近年来，随着化学稳定性的改进如作为第一代核酸药物的硫代磷酸修饰［5］、碱基修饰［6］及药物递送载体，如脂质体递送系统［7］及纳米载体结合细胞穿透肽［8］等新的递送系统的开发，使得半衰期较短的RNA 分子成为临床药物研究的新宠，在生物制药领域掀起了一股RNA 药物的热潮。

近年来，水产养殖业发展迅速，成为世界食物生产发展最快的产业之一。然而由于饲养密度的提高，养殖环境的恶化造成了水产养殖生物病害的频发。疾病暴发已成为水产养殖业发展的重要制约因素［9］。例如，病毒能引起大量水产动物的病害。在脊椎动物中发现的几乎所有类型的病毒家族现在都可以在鱼类中被找到［10］。有研究团队对9 个动物门中220 多种无脊椎动物标本进行转录组分析，发现了1 445 种全新的RNA 病毒，其中包括一些足以构成新家族的RNA 病毒［11］。最近，Shi 等［10］在两栖类、肺鱼、辐鳍鱼、软骨鱼和无颚鱼中确定了214个独特的、以前从未描述过的脊椎动物病毒种类，其中196 个特异地存在于爬行动物中。寄生虫也常引起病害，如几乎所有海水硬骨鱼均会被刺激隐核虫感染，对于海水鱼苗的感染率和死亡率有时可达100%［12］。由于目前尚无合适、有效针对刺激隐核虫的药物，导致一旦虫害爆发，造成的经济损失巨大。

RNA 药物在水产养殖病害的防治方面有重大的应用前景。在这篇综述中，我们首先简要回顾了RNAi 和CRISPR/Cas9 技术的起源、原理与应用，总结了RNA 药物的发展与应用。接着我们将重点放在该技术在抑制水产病毒和寄生虫方面的研究进展。最后结合我们团队的最新成果，讨论了RNA 药物的进一步发展，特别是在水产上的应用前景和未来方向。

1 RNAi 技术

RNAi 是指与相关基因或编码区域相对应的双链RNA（dsRNA）被引入细胞中，导致相应mRNA 降解的转录后基因沉默［13］。Guo 等［14］将par-1基因的正、反义链RNA 注射到秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，发现其能阻断该基因的表达，意外地观察到了双链RNA 在动物细胞中特异地抑制基因的表达。随后Fire 等［15］将mex-3基因的dsRNA 注射到秀丽隐杆线虫发现，dsRNA 能够高效特异性地抑制线虫中目的基因表达，并将这种效应称之为RNA干涉（RNA interference，RNAi）。随后多个团队在植物［16］、昆虫［17］、水产动物［18］等多种生物中也报道了类似的结果。

RNAi 作用原理可分为起始阶段和效应阶段，有些低等物种如秀丽隐杆线虫［19］和拟南芥［20］还存在级联放大阶段，其简明原理图如图1。起始阶段：由RNA 病毒入侵，转座子转录，基因组中反向重复序列转录产生的dsRNA 分子在细胞内被RNaseIII 家族中的Dicer 酶或其同源物剪成21-23 nt 的小干扰RNA（Small interference RNA，siRNA）。效应阶段：siRNA 被装载至其他一些相关蛋白复合物中如RNAi特异性的核酸外切酶、内切酶及辅助识别同源序列蛋白等，并形成RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。当RISC 结合上siRNA 后被活化并通过解旋酶的作用打开siRNA 的双链结构，形成单链siRNA。RISC 被活化后通过siRNA 反义链去寻找潜在的能与其互补的靶mRNA 序列并与之结合，然后RISC 复合物中的RNase 在靶mRNA与siRNA 结合区域的中间切断标靶mRNA，引发靶mRNA 的特异性降解。级联放大［21］：在RNA 依赖性RNA 聚合酶（RDRs）的作用下，以mRNA 为模板，siRNA 为引物，扩增产生足够数量的dsRNA 作为底物提供给Dicer 酶，产生更多的siRNA，从而使效应阶段反复发生。

RNAi 具有特异性地沉默靶基因的能力，已被广泛地用于通过降低表达而不改变基因型来研究特定基因的功能［22］。我们团队利用RNAi 研究了一些水产动物基因的功能。例如，在杂色鲍（Haliotis diversicolor）胚胎发育过程中加入其胰岛素样生长因子结合蛋白7（Insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7）的dsRNA 会引起发育的异常［23］；在体外培养的杂色鲍血淋巴中加入saIGFBP7的dsRNA 会显著影响培养的鲍血细胞中IGFBP7 的mRNA 和蛋白质表达并显著降低血淋巴的数量［24］。通过RNAi 技术我们还验证了暴露于缺氧，热应激，缺氧加热应激条件下的杂色鲍血淋巴中参与对低氧/热应激的免疫应答的基因和信号通路［25］。在研究缺氧应激后细菌感染引起的杂色鲍的免疫抑制的机制中通过RNAi 技术我们发现HdAKT 被抑制后PI3K-AKT 信号通路的多数基因受到抑制［26］。dsRNA 可通过细胞微管在细胞间传递，RNAi 不仅可用于研究基因功能、基因的表达调控，还可用于基因治疗、鉴定药物靶点和候选疫苗［27］，以及作为RNA 药物通过干扰病原体的传播，发育和增殖来控制传染病［28］。

图1 RNAi 简明原理图

2 CRISPR/Cas9 技术

成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是一个特殊的DNA 重复序列家族，其广泛分布于细菌和古细菌基因组中。Cas9 是一种在很多细菌中都可以表达的核酸内切酶，它在细菌中发挥着一种防御作用以避免外源DNA 如病毒或者质粒等的入侵。随后的研究发现CRISPR/Cas9 系统是针对入侵病毒病原体的一种细菌和古细菌的适应性免疫防御系统，其使用源自过去感染的病毒的RNA 片段经RNA 引导的核酸酶作用，通过互补碱基配对靶向切割病毒DNA［29］。根据核酸内切酶的识别和切割机制的不同，CRISPR/Cas 系统可分为Ⅰ型、II 型和Ⅲ型［30］。其中来自化脓链球菌的II 型CRISPRCas9 系统由于其组成简单，已被改造成为最简单和应用最广泛的基因组靶向编辑工具。其核心组分是RuvC 蛋白结构域和HNH 核酸酶结构域的内切核酸酶Cas9［31］，以及结合CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tra-crRNA）。crRNA 是由前体 crRNA经反式激活crRNA 和RNase ⅢNase 的［32］。crRNA将Cas9 蛋白引导到目标DNA 双链上并发挥核酸内切酶的作用，tra-crRNA 与crRNA 进行碱基互补配对，其中前20 个碱基确定Cas9 核酸内切酶的特异性。在与crRNA 指导序列互补的位点处，Cas9 的HNH核酸酶结构域切割互补链，而Cas9 的RuvC 蛋白结构域切割非互补链［33］，其机制图如图2。该系统发挥作用不仅需要crRNA 中存在与目标基因碱基互补配对的序列，还需要在目标基因的靶向结合区的下游存在前间区序列邻近基序（Protospacer adjacent motif，PAM）［34］。只 有 当 适 当 的PAM 位 于 目 标序列后面时，crRNA-tracrRNA 复合体才能够引导Cas9［35］。在不同的生物体中，PAM 序列不同。在研究广泛的化脓性链球菌中，PAM 序列为NGG［36］。

图2 CRISPR 原理模式图

随着研究的深入，研究人员用sgRNA［37］代替了crRNA 和tra-crRNA，sgRNA 序列中有一个模拟crRNA-tra-crRNA 复合体的发夹结构。sgRNA 由3部分组成：碱基互补配对区（Base-pairing region）、Cas9 把 手（Cas9 handle）和 终 止 子（terminator）。Cas9-sgRNA 在同源的靶序列中引入位点特异性双链DNA 断裂（Double strand break，DSB）后，细胞可以通过非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源定向修复（Homology-directed repair，HDR）两种方式对DNA 进行修复。NHEJ 修复途径诱导产生小的随机插入或缺失突变（插入缺失），使得靶基因编码区中的密码子发生移位，导致编码的基因功能的丧失［38-39］；HDR 途径是当质粒或单链寡核苷酸（寡聚）模板也存在时，基因组 DNA 通过与外源提供的DNA 模板进行同源重组引入特定靶位点的点突变或所需序列的插入/缺失，造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因，从而产生特异性和精确的核苷酸或序列替换［40］。

CRISPR/Cas9 系统代表了一种功能强大，高度特异性和适应性强的工具，可以纠正或治疗因细胞突变引起的癌症，如直接靶向癌基因受体酪氨酸激酶Erb2［41］。通过多重Cas9 永久性切除45-55外显子有望治愈杜兴氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）［42］。一些病毒病原体也已采用CRISPR 系统对病毒DNA 进行破坏，如使用针对性编辑多个基因来减少乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）核心和表面蛋白的产生［43］，靶向人乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）的E6和E7 基因从而抑制病毒［44］。靶向基因产生功能缺失突变体是一种基于反向遗传学来阐明其功能的常用方法。在水产动物方面，Sun 等［45］用CRISPR /Cas9 工具敲除对虾中的几丁质酶基因（EcChi4），然后用副溶血弧菌或嗜水链球菌攻击时发现，EcChi4基因缺失组的虾死亡率显着高于野生型虾，证实了几丁质酶基因在免疫防御中的功能。该技术将来可以研究其他十足动物无法轻易解决的重要生物学问题。Cai 等［46］使用CRISPR / Cas9 获得缺氧诱导因子抑制因子（Factor-inhibiting HIF，FIH）突变的斑马鱼发现，FIH缺失型的斑马鱼相比野生型对低氧条件的耐受性更高。Zhang 等［47］在对虾中采用CRISPR / Cas9 技术对EcMIH基因进行敲除发现，EcMIH基因敲除的对虾体长增加，并且发育时间缩短。同时，EcMIH的敲除没有引起诸如早期死亡或畸形的健康问题。使得CRISPR / Cas9 技术在水产育种中也具有广阔的应用前景。

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3 RNA 药物的发展与应用

寡核苷酸是一类20 个左右碱基的短链核苷酸（包括DNA 和RNA）的总称［48］。寡核苷酸可以很容易地和它们的互补链结合，所以常用来作为探针确定DNA 或RNA 的结构；而其作为药物候选应用的研究则始于大约30 年前，包括了ASO［49］，Aptamer等［50］及近15 年来对各类siRNA 的研究。在这期间，医药工业界开展了大量的临床试验。

3.1 RNA药物在医药工业界的发展与应用

早在1998 年美国药物管理局（FDA）就批准了其首个基因沉默“反义疗法”，一种名为Vitravene（fomivirsen）的药物，用于治疗免疫系统较弱的个体的巨细胞病毒感染。2013 年，赛诺菲（Sanofi）旗下的健赞公司（Genzyme Corporation）的寡核苷酸药物Mipomersen 上市，掀起了全球RNA 药物研发的热潮。RNA 药物将正式加入药物大军，成为继化学药物、生物蛋白药物之后的第三大新药类型。目前RNA 的药物主要有4 类：siRNA、ASO、Aptamer 和miRNA。其作用机理如表1。

表1 RNA 的药物的作用机理

RNA 药物用途广泛，可以治疗癌症、传染病、激素性疾病甚至亨廷顿病等神经性疾病，目前全球有多家RNA 药物研发公司在进行相关RNA 药物研发。2018 年8 月10 日FDA 批准了阿里拉姆制药公司（Alnylam）的RNAi 药物Onpattro（主要成分为Patisiran），其通过静脉注射用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性（Hereditary transthyretin-mediated，hATTR）引起的神经损伤。这是美国上市的第一个RNAi药物、也是第一个上市用于治疗hATTR的药物。该药将成为RNAi 现象被发现整整20 年以来上市的首款RNAi 药物［53］。

尽管RNA 药物的研发已有30 年历史，但目前市场上被批准生产的RNA 相关药物却很少（表2），而相关的用于农业病害防治的RNA 药物就更少了。

3.2 RNA农药在重要经济农作物害虫方面的研究与应用

小分子RNA 是RNA 药物的核心。目前主要是基于RNA 干扰技术和最新的CRISPR/Cas9 技术，两者都能用于抑制特定基因，阻止病害生物进行相关蛋白质的转录、翻译、表达。一些研究表明，dsRNA 可以通过人工饲料喂养昆虫或在转基因寄主植物中表达，导致目标物种的死亡［61-62］。目前研究和开发的重点是抗经济作物的重要害虫，包括西方玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera，WCR），南方玉米根虫（Diabrotica undecimpunctata howardii，SCR）、科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）［61］、棉铃虫（Helicoverpa armigera）［63］、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）［64］和褐飞虱（Nilaparvata lugens）［65］的RNA 药物。玉米根虫是北美最主要的农业害虫之一，其幼虫侵食玉米根部，引起玉米枯萎死亡，造成重大的经济损失。早在2003 年孟都山公司就进行大量投资，研发抗玉米根虫的产品。基于RNA 干扰技术，设计出Snf7直向同源物（DvSnf7）的dsRNA 来防治玉米根虫。有研究对DvSnf7 RNA 进行了详细的生态风险评估，表明其具有针对西方玉米根虫的靶向活性，与对照相比对生态不造成影响［66］。且对其他昆虫如DvSnf7的dsRNA 喂养的蜜蜂幼虫和成虫均未有任何不良影响［67］。2017 年6 月15 日美环保署批准了第一个以RNA 干扰技术为基础的一种特殊杀虫剂＜DvSnf7 dsRNA。这是RNA 药物正式应用在农业的首例。与传统杀菌剂需要喷施不同，该技术通过将DvSnf7 dsRNA 编码信息加入到SmartStax Pro 转基因玉米中。当西方玉米根虫开始取食植物时，这种植物自己产生的dsRNA 能够干扰玉米根虫的Snf7 基因，进而杀死害虫。当施用于土壤时，DvSnf7 RNA 会迅速降解，不会在环境中持续存在或积累［68］。DvSnf7 dsRNA的快速降解为未来基于RNA 的农产品的生态安全提供了依据。有研究将dsRNA 掺入水和沉积物的水柱中模拟未结合的dsRNA 或喷雾至植物组织引起的漂移，测定dsRNA 在水柱中的消散和分配至沉淀物的动态情况。发现dsRNA 在水柱中快速消散，并在96 h 后低于检测限，表明在分配到沉积物之前dsRNA已经在水柱中快速降解［69］。与转基因作物和化学农药不同的是，此类RNA 喷剂仅仅是让小分子的干扰RNA 覆盖在作物表层，杀死食用作物的害虫，整个技术也只是在基因表达的水平上进行调控，不对植物基因进行修饰，同时，RNA 干扰引起的基因沉默效应通常只会持续几天或者几周，不会出现毒素的累积。RNA 药物具有高效性、特异性，且不污染环境，无残留，因此具有很高的实用价值。

表2 已被批准上市生产RNA 相关药物

4 核酸药物基础技术在抑制水产病毒中的应用

4.1 RNAi参与动物的天然抗病毒防御机制

大多数生物在进化过程中已经发展出几种防御机制来感知和对抗病毒的感染。其中包括干扰素（Interferon，IFN）介导的［70］及如前所述的基于RNAi 的抗病毒机制［71］。

在病毒基因组中通常是在病毒复制期间产生的dsRNA 被宿主识别为与病毒感染相关的分子模式，诱导一系列免疫反应［72］。在脊椎动物细胞中，长dsRNA 的引入通常诱导先天性免疫反应，构成限制病毒复制的第一道防线［73］。病毒的dsRNA 在细胞内存在激活Toll 样受体3（TLR3）途径以及dsRNA识别蛋白（dsRNA 依赖性蛋白激酶PKR 和20-50 寡腺苷酸/核糖核酸酶L），导致RNA 转录物的非特异性降解，即IFN 反应的产生和宿主细胞蛋白质合成的整体关闭［74］。

由激活IFN 途径引起的非特异性抑制效应最初阻碍了RNAi 在脊椎动物细胞中的应用。Elbashir等［51］后来解决了这个问题，他们发现siRNA（大约20-25 bp）而不是长dsRNA（＞ 30 bp）可有效地敲低特定基因的转录物的量而不激活IFN 系统。因为高浓度的siRNA 被证明可以激活IFN 系统的成分故经常推荐使用最小的有效siRNA 剂量［75-76］。

4.2 抑制鲤疱疹病毒

疱疹病毒是有囊膜的双链线性DNA 病毒，感染对象包括哺乳动物、两栖类和鱼类等脊柱动物。鲤疱疹病毒属包含感染鲤鱼的I 型、II 型和Ⅲ型鲤疱疹病毒。Gotesman 等［78］在感染Ⅲ型鲤疱疹病毒的鲤鱼脑细胞中采用siRNA 抑制与Ⅲ型鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirus Ⅲ，CyHV-3）复制相关的胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）和DNA 聚合酶（DNA polymerase，DP）的表达发现，用靶向TK或DP基因的siRNA 处理感染了病毒的CCB 细胞能够减少病毒颗粒的释放，进而抑制CyHV-3 病毒的感染。在2016 年，Zhao 等［79］通 过CRISPR/Cas9 技术也对CyHV-3 病毒的基因TK和DP进行研究发现，Cas9-TK 能够抑制细胞中病毒DNA 的复制，但不能阻断病毒的释放；而Cas9-DP 诱导的病毒抑制作用虽然不如Cas9-TK 的效果强，但它却能阻断CyHV-3 病毒的释放，证实了CRISPR/Cas9 系统在防治CyHV-3病毒方面的有效性。

4.3 抑制对虾白斑综合症病毒

有几项研究表明，在病毒攻击之前施用病原体特异性dsRNA/siRNA 可以显著防止几种病毒种类如黄头病毒（Yellow head virus，YHV）［80-81］；桃拉综合征病毒（Taura syndrome virus，TSV）［82-83］和对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus，WSSV）［84-85］的复制。

WSSV 病毒是一种双链环状DNA 杆状型病毒，一旦感染对虾，病毒颗粒会遍布虾的体表和大多数组织并在血淋巴中无处不在地循环，病毒感染后3-7 d 内虾的死亡率可高达 100%。WSSV 基因组测序揭示了其为292 967 个碱基对构成的环状序列［86］。WSSV 病毒粒子由5 个主要的和约13 个次要的蛋白组成［87］。Xu 等［88］用一种特异性的21 bp 短干扰RNA（vp28-siRNA）处理感染WSSV 病毒的对虾发现，其能有效地降低感染WSSV 的虾的死亡率。在3 次注射vp28-siRNA 后，病毒可从被感染的虾体内被完全根除。序列特异性的vp28-siRNA 对vp28 基因的转录和表达的抑制导致病毒DNA 复制的抑制或延迟，表明VP28 蛋白参与虾的WSSV 感染。Alenton等［89］利用RNAi 技术去干扰WSSV 基因的非结构蛋白VP9 的功能，发现用VP9-dsRNA 和GFP-dsRNA注射的WSSV 感染的虾分别显示出80%和70%的存活率，相比之下，在25 dpi（Days post infection，感染后天数）时PBS 注射的虾的存活率为0%。使用较高的病毒浓度重新同时感染存活的虾和PBS 对照组未感染的新虾，与GFP-dsRNA 和PBS 组相比，VP9-dsRNA 的存活率为67%，而GFP-dsRNA 和PBS组的存活率为0%。表明VP9 基因在WSSV 的复制中发挥重要作用，能抑制WSSV 的感染，可开发为RNAi 治疗WSSV 感染的虾的有效靶基因。

4.4 抑制虹彩病毒

真鲷虹彩病毒（Red seabream iridovirus，RSIV）属于虹彩病毒科中的虹彩病毒属，是一种双链DNA病毒。该病毒基因组编码一个主衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP）基因和92 个特定的开放读码框架［90］，能感染真鲷等海水养殖鱼类，造成较大的经济损失。目前对真鲷虹彩病毒还没有很好的治疗方法，因此很有必要研究一种新的途径来抑制真鲷虹彩病毒的复制。Dang 等［91］针对真鲷虹彩病毒的MCP 基因设计siRNA（siR-MCP），用不同浓度的siR-MCP 或MCP 转染感染RSIV 病毒的比目鱼胚胎细胞（Hirame natural embryo，HINAE）发现，其对MCP mRNA 的表达有显著的影响，在病毒感染后84 和96 h，siR-MCP 分别使MCP 基因的表达降低了55.2%和97.1%，同时可检测到RSIV 的复制量的下降。siR-MCP 使MCP 基因的表达下降有效地和特异性地抑制了RSIV 复制，并阻碍细胞培养系统中病毒的产生，充分说明RNAi 抗真鲷虹彩病毒的高效性。

虎纹蛙虹彩病毒（Iridovirus-tiger frog virus，TFV）属于虹彩病毒科、蛙病毒属。主要感染蛙类，导致其大量死亡，造成重大的经济损失。由于虎纹蛙虹彩病毒免疫原性很低，常规的疫苗接种效果一般都不理想。RNAi具有高效降解同源mRNA 的特点，能有效地解决疫苗接种效果差的问题。Xie 等［92］通过表达的靶向MCP基因的siRNA 转染已感染TFV病毒的肥头鲤（Fathead minnow，FHM）肌肉细胞，通过定量PCR 检测发现MCP 的mRNA 表达水平降低、出现细胞病变效应推迟、细胞中TFV 滴度和病毒颗粒减少，表明靶向MCP基因的siRNA 的方法能有效抑制鱼类细胞中的TFV 复制，为养殖鲤鱼病毒的治疗提供了潜在的方法。

4.5 抑制草鱼呼肠孤病毒

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）为无囊膜病毒，该病毒的二十面体衣壳含有由11 个片段组成的线性双链RNA 基因组，共编码7 种结构蛋白和5 种非结构蛋白。草鱼呼肠孤病毒是危害性最大的草鱼病原体，能引起草鱼病毒性出血，常在水温25-30℃感染当年生的草鱼种，死亡率高。

Ma 等［93］在感染GCRV 病毒的草鱼肾细胞系（Ctenopharyngodon idelluskidney cell，CIK）中，针对草鱼呼肠孤病毒的连接黏附受体-A（Junctional adhesion molecule-A，JAM-A） 的DNA 序列用CRISPR/Cas9 基因编辑技术进行特异性的敲除发现，其能有效地抑制多种不同基因型的GCRV，表明草鱼JAM-A 对于GCRV 的感染是必需的，而特异性地敲除JAM-A 能有效地抑制病毒，是控制草鱼呼肠孤病毒的一种潜在方法。

5 在寄生虫防治的应用

在寄生虫病防治方面，通过RNAi 分析寄生虫基因功能不仅可以用来研究寄主与寄生虫之间的相互作用，而且还可以用来探索特定基因对寄生虫存活的影响。Ohashi 等［94］首次在新贝尼登虫（Neobenedenia girellae）通过浸泡dsRNA 来介导血管相关基因vlg1 和vlg2 的沉默发现，能降低该寄生虫的孵化率，证实RNAi 能成功干扰新贝尼登虫基因，也可用来研究寄生虫基因的功能。有研究采用RNAi技术针对鱼虱几丁质酶2（Chitinases 2，Chi2）基因和血红素过氧化物酶（Heme peroxidase 1，HPX1）基因的进行干扰发现，均能降低鱼虱幼虫运动能力、降低其对宿主的感染能力［95］。这些研究有助于鉴定和验证新的抗寄生虫药的靶标和进一步发展基于RNAi 的水产抗寄生虫药物。

自从发现CRISPR 技术以来，在寄生虫学领域，CRISPR / Cas9 技术的使用一直在迅速发展。Peng 等［96］通过用Cas9 编码质粒和体外转录的sgRNA 共转染克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）证明了CRISPR / Cas9 系统在寄生虫领域的可行性。目前CRISPR / Cas9 已成功地适应许多寄生虫系统，包括弓形虫（Toxoplasma gondii）［97］、隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）［98］和阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）［99］。

Crawford 等［100］通过用重组SpCas9，体外转录的sgRNA 和200 个核苷酸的单链寡脱氧核苷酸（用于DNA 修复）转染恶性疟原虫，实现了恶性疟原虫的基因组编辑。但是，这项研究报道只有23%的转染产生了正确编辑的寄生虫。Shrivastava 等［101］使用CRISPR-Cas9 系统删除利什曼原虫（Leishmaniaspp）前鞭毛体中的单个LeishIF4E-3基因，产生具有降低LeishIF4E-3表达的异源缺失突变体。该突变体表现出新生蛋白合成和生长动力学的下降、形态的改变和感染性的减弱。

目前有效治疗弓形虫感染的药物只有磺胺类药物，但由于磺胺类药物不仅副作用大，还无法有效治疗隐形感染阶段的幼虫，因此需要一种新的有效药物来代替。Zheng 等［102］利用CRISP/Cas9 基因编辑技术敲除编码弓形虫的亮氨酸氨基肽酶基因后能影响弓形虫的生长复制，虽未能完全阻断寄生虫的发育、毒力或酶活性，但对弓形虫入侵宿主细胞起到了重要的抑制作用，可以作为用来治疗弓形虫病的辅助药物靶标。对寄生虫疫苗的研究仍处于早期阶段，迄今尚未有成功的方法来生产有效的市售疫苗来防治鱼类寄生虫。

6 结语

水产养殖病害防治主要有药物防治、微生态制剂、免疫预防，以及最近新兴的RNA 生物农药治疗等方法。但其中可使用的疫苗或有效药物非常有限。常规的药物防治以化学农药和抗生素为主，虽然具有防治方法简便、可控性好等优点，但潜在的风险也大，药物残留问题引起各种食品安全以及对生态环境的破坏等问题。微生态制剂不仅克服了有毒物质在动物体内的累积，而且还能提高养殖对象的免疫力。但目前大多数微生态制剂还是为陆地动物设计的。免疫预防现阶段只停留在实验模式阶段，目前在水产方面的商品化疫苗只有草鱼出血病灭活疫苗，但通过疫苗来进行免疫预防需要进行逐一注射，耗时费力。已经有学者提出，基于RNAi 的RNA 药物可应用于水产养殖以对抗由病毒和寄生虫引起的各类疾病［103-104］。RNA 药物在水产养殖病害防治中与传统化学药物相比具有以下优势：（1）不会以任何形式改变宿主的遗传结构；（2）具有可以生物降解的优点，在野外会迅速分解；（3）克服了动物体内有毒物质的积累，在提高动物特异性免疫水平的同时亦能增强机体的抗应激能力；（4）符合不污染环境、水产食品无药物残留的要求。此外，RNA药物还具有如下的优势：（1）易于构建、制备和大量生产。Ongvarrasopone 等［105］使用RNaseIII 缺陷型大肠杆菌菌株（HT115）提出了一种简单而经济的体内生成大量dsRNA 的系统。通过该方法，表达dsRNA 的细菌可以通过纯化步骤以分离所需的dsRNA，或者直接掺入到颗粒饲料中经口服递送。基于该方法，Saksmerprome 等［106］修改后也成功生产了大量的稳定的基于载体的发夹dsRNA。目前认为经口服递送是RNA 药物在水产养殖病害防治中最可行的递送方法［107］。（2）特异性；（3）本身具有佐剂的功效［108-109］。RNAi 和CRISPR/Cas 介导的干扰［110］，以及使用小分子促进内源宿主对病毒感染的反应［111-112］是处理水生医学疾病的强大新兴治疗策略。

目前在水产方面的RNA 药物尚未发展出商品化的药物，但在抗水产动物病原的实验研究阶段已出现了很好的前景，进一步的深入研究有可能研发出可克服成本高，很难大规模的工业化生产和广泛的推广应用的困难，为水产业的病害防治提供一条新的解决途径。