T-2毒素在马铃薯品种对镰刀菌干腐病抗性评价中的应用

贺付蒙，单玮玉，赵潇璨，武佳文，朱元芳，周 磊，石奇海，刘 娣，李凤兰

(1.东北农业大学 生命科学学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院，哈尔滨 150086)

马铃薯(Solanumtuberosum)为茄科茄属，是世界第四大粮食作物，是中国重要的经济作物，因其块茎淀粉含量高且营养全面，既可作为蔬菜也可用于餐桌主食，是重要的粮食作物[1]。大多数马铃薯在收获后要进行半年之久的窖储，而在贮藏期易发生马铃薯病害，主要包括马铃薯晚疫病、环腐病、干腐病和黑胫病等[2]。其中马铃薯干腐病是造成薯块腐烂的主要原因之一，其主要致病菌是镰刀菌，包括三线镰刀菌(Fusariumtricinctum)、拟丝孢镰刀菌(Fusariumtrichothecioides)、拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotriodides)、梨孢镰刀菌(Fusariumpoae)等，发病后会导致马铃薯腐烂，甚至烂窖，严重影响产量，造成的年损失量达6%以上[3]。T-2毒素则是镰刀菌在特定条件下产生的有毒次生代谢产物，属于单端孢霉烯族，一种倍半萜烯化合物，该毒素在谷物和饲料中污染严重，已在世界各地广泛分布，其中在中国谷物中检出率高达80%[4-5]。T-2毒素对于动植物及人类都具有一定的毒性，但有研究表明低浓度T-2毒素可通过诱导马铃薯的苯丙烷代谢而增强块茎对干腐病的抗性[6]。

近年来，真菌毒素残留于食物中的安全问题一直是人们关注的焦点，杨亚君等[7]对处理了腐霉枯萎病毒素的坪草进行抗病性鉴定，研究经毒素处理后不同品种的抗病性，结果发现‘草地早熟禾’抗病性最强，其次是‘高羊茅’和‘甸甸剪股颖’，‘黑麦草’感病性较强。何明霞等[8]利用粗毒素和菌丝体接种鉴定方法对云南地区9个不同橡胶品种抗棒孢霉落叶病进行评价，结果表明不同的橡胶品种对粗毒素鉴定表现的抗性程度不同，‘云研77-2’表现为抗病，‘云研77-4’表现为轻感病，‘RRIM600’表现为轻感病或易感病。左示敏等[9]研究水稻对毒素的抗性反应，进行水稻品种抗病性鉴定，发现经一定浓度的毒素处理后水稻植株可引起超氧化物歧化酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性升高，抗病品种的酶活反应明显高于感病品种。单玮玉等[10]采用马铃薯干腐病 2 个致病性不同的菌株—强致病性的燕麦镰刀菌和弱致病性的拟枝孢镰刀菌，针对黑龙江省 21 个主栽马铃薯品种对其进行抗病性评价，采用病级分类方法和系统聚类分析方法将马铃薯品种抗病性分为抗病、中抗、感病3 类。

本试验以此为基础，采用 T-2毒素对不同抗性的马铃薯进行抗病性评价，对其抗病生理生化特性进行研究，确定T-2毒素是否能作为抗病筛选的一种指标，以期为马铃薯抗干腐病品种的推广和选育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

马铃薯3个不同抗性品种分别为：感病品种‘鲁引1号’、中抗品种‘东农310’和抗病品种‘东农311’(东北农业大学生命科学学院植物资源与分子生物学研究室提供)。

T-2毒素标样为FERMENTEK公司产品。

1.2 方 法

1.2.1 T-2毒素作为马铃薯品种干腐病抗性筛选指标的质量浓度确定 选择外观整齐、无损伤的马铃薯块茎，清洗后用75%酒精浸泡30 s，然后用5%的次氯酸钠溶液浸泡5 min，最后用无菌水反复冲洗3次，置于超净工作台中晾干，用直径1 cm的打孔器在晾干后的马铃薯块茎中央打出小孔(h=1 cm)，备用。

将T-2毒素标样进行稀释，稀释成不同质量浓度的T-2毒素(0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、60 ng/mL和70 ng/mL)，将其分别用移液枪打进3种抗性马铃薯孔中，然后将组织塞回，再用浸湿的纸巾包裹，放入25 ℃恒温恒湿的培养箱中培养 5 d。取出马铃薯块茎，沿着穴窝中心垂直切，用十字交叉法测病斑大小，每组试验重复3次。

1.2.2 T-2毒素处理马铃薯块茎生理生化指标的测定 根据前期试验，筛选出质量浓度为50 ng/mL的T-2毒素作为筛选指标，将其分别侵染3种抗性马铃薯块茎，处理方法同“1.2.1”。然后在0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h时，在病斑交界处取样，放入液氮中冷冻，于-80 ℃冰箱中保存，随后进行生理生化指标测定。每组处理进行3次重复测定。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑( NBT) 法，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚显色法，可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法，还原糖含量测定采用3，5-二硝基水杨酸法，丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸法，试验方法参照文献[11]。4-香豆酰-辅酶A连接酶(4CL)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参照杨志敏等[12]的方法。

1.2.3 数据处理与分析 所有数据都是3次重复的平均值，以“平均值±标准误”表示，采用 Microsoft Office Excel 2007 软件对试验数据进行处理，用 SPSS 20.0 统计软件进行方差分析，采用新复极差法(Duncan’s)进行差异性检验。

2 结果与分析

2.1 T-2毒素作为马铃薯品种干腐病抗性筛选指标的质量浓度

由图1可知，不同品种的马铃薯块茎在未处理T-2毒素时趋于平稳状态，T-2毒素处理后，3种抗性马铃薯块茎病斑比例会随T-2毒素质量浓度的升高而呈现先升高后降低的趋势。当T-2毒素质量浓度为50 ng/mL时，3种抗性马铃薯块茎病斑比例都达到最高，在T-2毒素处理质量浓度为50 ng/mL至70 ng/mL时，其病斑比例都呈下降趋势，且3个品种间病斑比例具有明显差异。因此，以50 ng/mL T-2毒素作为马铃薯抗干腐病抗病性的最佳筛选质量浓度。

2.2 T-2毒素对不同抗性马铃薯品种生理指标的影响

2.2.1 经T-2毒素处理后不同抗性马铃薯块茎腐烂面积变化 由图2可知，3种不同抗性马铃薯品种经T-2毒素处理后，随处理时间的延长腐烂面积都会变大，但抗病品种‘东农311’腐烂面积变化最小，中抗品种‘东农310’其次，感病品种‘鲁引1号’腐烂面积变化最大。

2.2.2 T-2毒素处理后马铃薯块茎生理生化指标 3种抗性马铃薯块茎经T-2毒素处理后，SOD、POD 和 MDA测定结果如图3所示，SOD活性整体趋势呈波浪式变化(图3-a)，且抗病品种‘东农311’和感病品种‘鲁引1号’的SOD活性均高于对照组，中抗品种‘东农311’在12 h处理时低于对照。处理组之间抗病品种‘东农311’的SOD活性最高，其在12 h达到最高为44.8，且与其他两个品种具有明显差异，感病品种‘鲁引1号’SOD活性最低。

POD活性随时间的变化呈先上升后下降的趋势(图3-b)，且处理后3个品种的POD活性均比对照组高。处理组之间抗病品种‘东农311’及中抗品种‘东农310’的 POD活性比感病品种‘鲁引1号’高，且具有明显的差异；抗病品种及中抗品种POD活性在24 h时达到峰值，抗病品种为65，中抗品种为56，随后POD活性开始降低。

MDA含量都呈先上升后下降趋势(图3-c)，抗病品种‘东农311’在24 h达到峰值，中抗品种‘东农310’是12 h最高，而感病品种‘鲁引1号’则是在36 h时最高，分别为1.9、2.1和2.3，整体上感病品种‘鲁引1号’的MDA含量较其他两个品种更高。

3种抗性马铃薯块茎经T-2毒素处理后，PAL、4CL、可溶性糖和还原糖测定结果如图4所示，PAL活性呈波动式上升，且PAL活性均高于照组(图4-a)。整体上抗病品种‘东农311’和中抗品种‘东农310’均比感病品种‘鲁引1号’PAL活性要高，但在处理36 h时‘鲁引1号’PAL活性高于其他两个品种且是达到峰值。

抗病品种‘东农311’的4CL活性整体呈上升趋势(图4-b)，且4CL活性高于其他两个品种，在24 h时到达峰值为0.3；中抗品种‘东农310’和感病品种‘鲁引1号’的4CL活性则是先升高后降低的趋势，峰值分别为0.19和0.21。

可溶性糖含量变化都是先上升后下降的趋势，且均比对照组高(图4-c)。抗病品种‘东农311’和中抗品种‘东农310’比感病品种‘鲁引1号’可溶性糖含量高，两个品种都在24 h时达到最高峰，分别为0.98和1.17；感病品种‘鲁引1号’则是在36 h到达峰值为0.7。

T-2毒素处理3种抗性马铃薯块茎后还原糖含量变化趋势不明显，但处理组还原糖含量均比对照组高(图4-d)；抗病品种‘东农311’还原糖含量整体趋势高于中抗品种‘东农310’和感病品种‘鲁引1号’，其中感病品种‘鲁引1号’还原糖含量最低。

3 讨 论

毒素是病原菌产生的有毒物质，经毒素处理后寄主会发生明显的病害现象，利用毒素筛选抗病品种是国内外研究的热点。Matsumoto等[13]采用了不同浓度梯度的香蕉枯萎病菌毒素对香蕉进行处理，结果分析发现香蕉的再生突变体植株的抗病性比野生型植株强。张笑宇等[14]用黑痣病菌毒素诱导不同品种马铃薯幼苗，对其体内防御酶活性的变化，MDA含量、细胞膜透性及PAL活性的变化进行了研究，结果表明抗病品种马铃薯较感病品种有更强的抵御能力。

SOD和POD是生命体内的活性物质，能消除生物体在新陈代谢中产生的有害物质，李凤兰等[15]采用拟丝孢镰刀菌对‘大西洋’和‘克山 1’的薯块进行侵染，在不同时间对其内部的SOD 活性和POD 活性进行测定，结果表明不同抗性的马铃薯被拟丝孢镰刀菌侵染后，薯块内SOD呈上升趋势，抗性品种内的 POD 酶活性高于感病品种，表明 SOD、POD 酶活性同抗病性密切相关。本试验中，处理组的SOD和POD活性均比对照组高，且处理组抗病品种的SOD和POD活性高，说明SOD和POD的活性变化与马铃薯品种抗病性有关，与前人的报道相一致。

MDA含量会体现出病原菌侵染马铃薯茎基后诱发茎基自身反应。拓宁[16]对侵染了立枯丝核菌而导致的马铃薯黑痣病的茎基组织进行生理生化测定，结果发现，立枯丝核菌对马铃薯茎基组织的MDA含量产生显著影响，接种茎基发病部分的MDA含量均高于健康部分。在本试验中，马铃薯不同抗性品种经T-2毒素处理后发现感病品种的MDA含量比中抗和抗病品种的数值较高，说明抗病品种较其他品种具有较强的MDA清除能力，对逆境更具有抗性。

PAL、4CL为控制木质素合成的关键酶[17-18]，PAL 存在于大部分高等植物中，植物抗病性的强弱与其活性有重要联系，其影响植物木质化过程并在抗虫、抗逆等过程中起到重要作用[19]。4CL 是植物调控木质素代谢、参与类黄酮和其他次生代谢产物合成的关键酶，位于苯丙氨酸生物合成途径的分支点上，控制碳流进入下游不同代谢支路，是植物体内最主要的抗菌物质，侵染组织周围代谢产物的积累能有效抑制病原菌的扩展[20]。在本试验中，T-2毒素可诱导不同抗性品种块茎内PAL和4CL活性增加，抗病、中抗和感病品种PAL和4CL活性均比对照组高，说明PAL和4CL活性的增高能提升马铃薯块茎抵抗病害的能力。

刘喜平等[21]为了提高马铃薯品质，对4个品种在4个不同生态条件下的还原糖含量分析显著性，结果表明，还原糖数值的体现为不同地域间的不一致大于品种间的差别，还原糖数值受地域环境和品种的影响。本试验测定了马铃薯不同抗性品种块茎的可溶性糖和还原糖，结果发现，抗病、中抗和感病品种的糖含量均比未侵染T-2毒素的对照组高，且抗病品种最高，这说明抗病品种可以更好的维持渗透平衡，维持植物的正常代谢。

综上所述，利用干腐病镰刀菌产生的T-2毒素作为马铃薯抗病品种的筛选方法是可行的，但马铃薯在受病害时其他生理变化等还尚不明确，需进一步探究，以更好的揭示马铃薯干腐病抗病的机制。