PAK5/β-catenin信号通路在乳腺癌细胞多药耐药中的作用及机制

2021-04-25巩婵婵李艳青陆夏良

临床与实验病理学杂志 2021年3期

巩婵婵，李艳青，展瑞，汤颖，陆夏良

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率以每年0.2%～8%的幅度上升，严重威胁女性身心健康[1-2]。肿瘤细胞多药耐药的产生是导致乳腺癌治疗失败的主要原因之一，因此，研究乳腺癌细胞耐药的分子机制，对发现新的治疗靶点具有重要意义[3]。PAK5是p21激活激酶(p21-activated kinase, PAK)家族中的成员之一[4]。研究表明，PAK5可通过调控NF-κB促进乳腺癌细胞增殖，并参与乳腺癌细胞侵袭、迁移过程[5]。此外，PAK5还参与了肝癌细胞及食管鳞状细胞癌对顺铂的耐药[6-7]，PAK5表达可使卵巢癌细胞对紫杉醇产生耐药[8]。因此，PAK5很可能参与了肿瘤细胞的耐药进程，而PAK5在乳腺癌细胞耐药中的机制仍不清楚。本实验旨在验证PAK5在乳腺癌细胞产生耐药中的作用，并探讨PAK5对β-catenin通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料人乳腺癌细胞BT-549、MDA-MB-231购自中国科学院细胞所。RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司，L-15培养基、CCK-8细胞增殖试剂盒购自凯基生物公司；无支原体胎牛血清购自中国杭州四季青公司；胰酶购自美国Sigma公司；抗PAK5抗体购自美国Abcam公司，β-catenin抗体购自Santa Cruz公司，PAK5过表达质粒购自上海艾博思生物公司。PAK5干扰序列购自上海吉玛基因公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京碧云天公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂购自Roche公司。

1.2 细胞培养与耐药株诱导乳腺癌细胞株BT-549、MDA-MB-231分别于含10%胎牛血清的RPMI-1640、L-15培养基中，加入适量青霉素-链霉素溶液(双抗)，在含5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。取对数生长状态良好的BT-549和MDA-MB-231细胞常规胰酶消化后，离心弃上清，后重悬取约106个细胞接种于含阿霉素(ADR，初浓度0.02 μg/mL)、紫杉醇(PTX，初浓度为0.2 μg/mL)的培养基中，待细胞存活状态稳定后，不断提高药物浓度，直到其IC50值至少达到亲本细胞IC50值的10倍以上，并能在RPMI-1640(L15)培养液中稳定地生长，持续传代。后定期给予一定浓度的阿霉素或紫杉醇，间断刺激。

1.3 CCK-8细胞增殖实验胰酶消化对照组与实验组(耐药细胞株为实验组时，其对应的亲本细胞株为对照组；PAK5过表达组为实验组时，其对照组为转染空载质粒组；干扰PAK5组为实验组，其对照组为干扰无关序列组)。向96孔板每孔铺5×103个细胞。一竖排铺5个孔，每孔为含10%FBS完全培养基稀释的细胞100 μL；将铺好细胞的96孔板，分别加药后，置于细胞培养箱中分别培养24、48、72、96 h；将添加CCK-8检测液的96孔板再放入培养箱中继续孵育0.5、1、2、4 h；在相应的4个时间点拿出96孔板置酶标仪450 nm处测定相应孔的OD值。

1.4 克隆形成实验将对照组和实验组进行细胞消化计数，在6孔板中加入含10%FBS完全培养基3 mL，同时每行3个孔为一组，细胞数分别为100、300、500，实验孔细胞数与其相对应，分别加药后，将6孔板放入培养箱中培养。定期进行细胞换液，观察10～14天，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，即终止培养。弃去培养基，用PBS缓冲液浸洗后吸出；加入4%多聚甲醛固定15 min，后弃固定液，加适量结晶紫(或Giemsa)染色10～30 min，空气干燥；将各孔置于白色背景下拍照，最后进行统计学分析并作出统计图。

1.5 Western blot法收集对照组和实验组细胞，用RIPA裂解液充分裂解。按试剂盒方法提取总蛋白，将各组样品配平，以配制成同体积同浓度同质量的样品。按SDS聚丙烯酰胺凝胶制备分离样品，NC膜进行转膜(湿转)，5%脱脂牛奶封闭，孵育一抗(PAK5，稀释比1 ∶1 000；Actin，稀释比1 ∶5 000)4 ℃过夜；将NC膜取出，室温复温30 min，Washing buffer洗膜；孵育二抗，室温条件下2 h，Washing buffer漂洗NC膜，滴加ECL发光液，显色。

1.6 细胞免疫荧光定位对照组与实验组细胞生长至80%～90%融合度后，接种于铺有盖玻片的6孔板内，待亲本细胞融合度达70%时开始转染；耐药株细胞不作转染处理，培养24 h后，吸出原有培养基，加入提前预冷的4%多聚甲醛，室温条件下固定15～20 min；后加入0.5%TritonX-100，室温下孵育10 min；5%BSA封闭1 h(勿洗)；孵育一抗(β-catenin，稀释比1 ∶100，用5%BSA作稀释液)，4 ℃过夜；次日取出6孔板，于室温条件下复温30 min；孵育二抗(稀释比1 ∶200，用5%BSA作稀释液)，注意避光操作；后进行核染色；完成后取出盖玻片，略晾干，封片。荧光显微镜下观察拍照。

1.7 罗丹明实验对照组与实验组细胞生长至约70%融合度时，用含2%罗丹明的完全培养基培养，置于37 ℃温箱中30～50 min，后弃去培养液，PBS漂洗，荧光显微镜下观察拍照。

1.8 免疫共沉淀提取对照组和实验组细胞总蛋白，BCA测蛋白浓度；分为三个样品组：Input(80 μg)、对照组(1 mg)、实验组(1 mg)；实验组加抗PAK5蛋白抗体(5 μg)，对照组加兔源IgG，4 ℃过夜；Input组存放于-20 ℃冰箱。实验组及对照组加proteinA/G珠子(约30 μL)，4 ℃条件下旋转混合2～4 h；将对照组与实验组4 ℃离心，去上清，后用Western及IP细胞裂解液洗3遍(每次1 mL)，2 000 r/min离心1 min；加30 μL的2×Loading buffer，煮沸15 min；4 ℃，12 000g离心15 min，取上清；将所取样品及Input组进行Western blot实验。

2 结果

2.1 构建乳腺癌耐药细胞模型选择两种常见的人乳腺癌细胞株BT-549和MDA-MB-231，阿霉素或紫杉醇小剂量浓度递增法建株，成功构建BT-549耐阿霉素细胞株(BT-549/ADR)、BT-549耐紫杉醇细胞株(BT-549/PTX)、MDA-MB-231耐阿霉素细胞株(MDA-MB-231/ADR)和MDA-MB-231耐紫杉醇细胞株(MDA-MB-231/PTX)。为进一步验证构建的乳腺癌耐药株细胞的耐药能力，将4种耐药株细胞分别加药培养后进行CCK-8细胞增殖实验，结果显示，与亲本细胞相比，耐药细胞株在24、48、72、96 h时细胞增殖均明显升高(P<0.001，图1)。同时，将4种耐药株细胞加药培养后进行克隆形成实验，结果显示，与亲本细胞株相比，耐药细胞株能形成大量的细胞集落，差异有统计学意义(P<0.001，图2)。上述实验表明，与亲本细胞相比，耐药细胞的增殖能力明显增强。

图2 克隆形成实验检测乳腺癌耐药细胞株的克隆形成能力：A.BT-549/ADR；B.BT-549/PTX；C.MDA-MB-231/ADR；D.MDA-MB-231/PTX

2.2 PAK5对乳腺癌细胞耐药株的影响Western blot法检测耐药细胞株中PAK5表达情况，结果显示，与亲本细胞相比，耐药细胞株中PAK5蛋白表达增加(P<0.001，图3)。乳腺癌细胞株中PAK5过表达，CCK-8实验结果显示，与对照组相比，PAK5过表达组的细胞增殖能力明显增强(P<0.001，图4)。乳腺癌细胞株中分别过表达PAK5和干扰PAK5，依次加药后，采用CCK-8细胞增殖实验检测其IC50值，与对照组相比，PAK5过表达组的IC50值明显增加，而PAK5干扰组的IC50值则明显降低(表1)。在乳腺癌细胞株中过表达PAK5后行罗丹明染色，结果显示，与对照组相比，PAK5过表达组的荧光强度更弱；对乳腺癌亲本细胞及其耐药株进行罗丹明染色，结果显示，与亲本细胞相比，耐药株细胞中的荧光强度更弱(图5)。上述实验结果提示，PAK5可以促进乳腺癌细胞产生多药耐药，且可能是通过影响其耐药蛋白的表达。

表1 乳腺癌细胞株BT-549和MDA-MB-231不同处理条件下的IC50值

图3 Western blot法检测乳腺癌耐药细胞株中PAK5的表达：1. BT-549;2.BT-549/ADR;3.BT-549/PTX;4.MDA-MB-231;5.MDA-MB-231/ADR;6.MDA-MB-231/PTX; 与乳腺癌亲本细胞株相比，***P<0.001

图4 PAK5可促进乳腺癌细胞的增殖：A.BT-549；B.MDA-MB-231；与对照组相比，***P<0.001

2.3 PAK5对β-catenin信号通路的影响乳腺癌细胞中过表达PAK5后行细胞免疫荧光实验观察β-catenin表达，结果显示，与对照组相比，PAK5过表达组中β-catenin表达明显增加，且以细胞核内增加为主(图6)。同时，亲本细胞株与耐药细胞株的免疫荧光结果显示，与亲本细胞株相比，耐药细胞株中β-catenin表达显著增加(图6)。为进一步探究PAK5与β-catenin的关系，本实验行免疫共沉淀实验，结果显示PAK5可以与β-catenin相结合；与亲本细胞株相比，在耐药细胞株中的结合增加(图7)。上述实验结果显示，PAK5可以与β-catenin结合，且促进其表达。

3 讨论

化疗在乳腺癌综合治疗中起着不可替代的作用，但往往会由于肿瘤细胞产生多药耐药，导致化疗无效或逐渐转为无效，严重影响患者的生存质量和生存率[9-10]。因此，寻找肿瘤细胞产生耐药的分子机制，可能为乳腺癌临床的治疗提供新的潜在作用靶点。PAK5是PAK家族中的成员之一，在多种肿瘤的发生、发展中起重要作用，而PAK5在乳腺癌细胞耐药中的作用仍有待于进一步研究。

本实验通过阿霉素及紫杉醇小剂量浓度递增法构建4种乳腺癌耐药株细胞，与亲本细胞株相比，耐药细胞株的细胞增殖能力增加，这些结果证实，构建的耐药细胞株具有稳定的耐药能力。此外，Western blot实验表明，PAK5在耐药细胞株中表达增加；CCK-8实验显示，PAK5过表达可促进乳腺癌细胞增殖。罗丹明123(Rhodamine 123)是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，可以作为一种荧光指示剂，在耐药细胞株中被作为细胞内底物泵出细胞外，而使细胞内的荧光减弱。该实验结果表明，与亲本细胞相比，耐药细胞株中的耐药蛋白表达增多；且PAK5可影响乳腺癌细胞中耐药蛋白的表达。Wnt/β-catenin信号转导通路在多种癌症的发生、发展中起重要作用，Wnt信号通路激活后可抑制β-catenin的降解及磷酸化，导致其在细胞质或细胞核内的含量蓄积，启动与癌症相关的基因转录。细胞免疫荧光结果显示，在乳腺癌细胞中过表达PAK5，β-catenin的表达也增加，且以细胞核的增加为主；同时，与亲本细胞株相比，耐药细胞株中β-catenin表达也是增加的。免疫共沉淀结果证实，PAK5与β-catenin结合，且在耐药细胞株中的结合增加。以上结果表明，PAK5可促进乳腺癌细胞产生耐药，且可能是通过结合并促进β-catenin的转录活性实现的。

β-catenin是Wnt信号通路的核心调控因子，与肿瘤的发生、发展密切相关[11-12]。本实验揭示了PAK5通过β-catenin参与乳腺癌细胞耐药的产生，为临床乳腺癌患者耐药的治疗提供了新的理论依据。