ApoE 基因多态性和血清亲环素A 对高血压脑出血患者认知功能的影响

赵海港 梁亚丽 齐连生 徐炳欣

河南科技大学许昌市中心医院，河南 许昌461000

缺血性脑血管认知障碍是血管性认知障碍的主要类型之一，在老年型认知障碍诱因中位列第二，具有较好的均质性和较高的发病率，已成为世界重点关注的公共卫生课题。研究表明脑血管疾病已成为影响我国居民生命健康的高发疾病之一，在老龄化越来越严重的背景下，该病的发病率呈逐年增长趋势，并受年龄、高血压、糖尿病、高脂血症、冠心病等多种高发基础疾病的影响。另外，小动脉硬化、血管周围间隙扩张、静脉胶原蛋白沉积、脑淀粉样血管病、脑微出血、脑微梗死等病理改变也可导致缺血性脑血管认知障碍的发生［1-3］。因此，以风险因素作为防治出发点并不具备临床特异性，也很难有较高的灵敏性。动物实验显示，机体代谢功能水平和遗传因素也可能参与了缺血性脑血管认知障碍的病变过程，但在临床研究中尚未获得更多的证据。临床研究目前获得的可能与缺血性脑血管认知障碍有关的认识普遍为金属蛋白酶、血管内皮生长因子、血管紧张素Ⅱ和血脑屏障的改变，表现为其水平在早期功能障碍发生时即已出现显著改变，并可随着认知功能严重程度的加剧而发生显著变化，但病理机制尚需更多的证据。

近年来有关缺血性脑血管疾病患者载脂蛋白E基因多态性的研究较多，但有关高血压脑出血与载脂蛋白E基因多态性关系的研究较少，且尚无定论［4-6］。多数研究表明，载脂蛋白E 基因是影响痴呆发生的备选基因之一，且有研究证实缺血性血管疾病并携带载脂蛋白Eε4 等位基因患者发生认知障碍的可能性显著高于未携带者，但具体作用机制尚不明确［7-9］，而亲环素A 在载脂蛋白Eε4 等位基因引发神经元发生退行性变和血管功能异常的过程中有关键性作用［10-11］。本研究旨在探索ApoE基因多态性和血清亲环素A对高血压脑出血患者认知功能的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015-07—2018-08 在许昌市中心医院治疗的136 例高血压脑出血患者为研究对象，其中男62例，女74例；年龄24～62岁，病程0.7～5.8 个月。采用蒙特利尔认知量表进行评估并根据结果将136例患者分为2组，88例认知评分＜26分的患者为认知障碍对照组，48 例认知评分≥26 分的患者为非认知障碍组。

纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）确诊为高血压脑出血；（3）患者及其家属知情并签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他脏腑功能障碍者；（2）蒙特利尔认知评估量表≥26分；（3）帕金森病和阿尔兹海默等可能引发认知障碍的疾病。

1.2 研究方法 采集2 组患者的清晨空腹静脉血，经离心机离心后分离出血清并冷冻保存进行相关指标检测。采用Snapshot 检测法进行载脂蛋白E 基因型进行检测，提取白细胞DNA 后进行PCR 扩增试验，反应条件为52 ℃、5 s，60 ℃、30 s，96 ℃、10 s以及96 ℃、60 s，设计引物序列共30个循环；将延伸产物取出，加入去离子甲酰胺变性后，冰水上浴并采用测序仪（美国ABI 公司）进行测序。亲环素A 根据试剂盒说明书（北京奥威亚生物科技有限公司提供）进行酶联免疫吸附法检测。检测并比较2 组患者载脂蛋白E基因型和等位基因的频率分布情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）描述，组间比较采用t检验。计数资料以率（%）描述，比较采用χ2检验。每个等位基因的平衡检验为Hardy-Weinberg 遗传平衡检验。影响因素综合分析为多因素非条件Logistic回归。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组患者载脂蛋白E 基因型和等位基因频率分布比较

2.1.1 各等位基因的基因平衡检验：分别对各等位基因型行Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，绝大多数组合符合遗传平衡（P＞0.05），具有恒定性。但非认知障碍组（n=48）中的ε3-ε4 等位基因组合系，Hardy-Weinberg 遗传平衡检验P=0.013，提示其不符合遗传平衡，可能属于样本量较小（杂合子样本偏小），有一定偏倚。见表1。

2.1.2 2 组患者载脂蛋白E 基因型和等位基因频率分布比较：认知障碍组的3/4基因型和ε4等位基因占比分别为25%、21.59%，相比非认知障碍组的8.33%、8.33%明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。而认知障碍组的3/3 基因型和ε3 等位基因占比分别为48.86%、67.61%，相比非认知障碍组的77.08%、85.42%明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.2 高血压脑出血患者认知功能障碍发生因素的单因素分析 2 组患者的受教育年限、糖尿病发生率、吸烟率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。知障碍组高血脂率、血清亲环素A＞180 占比分别为71.59%、80.68%，相比非认知障碍组的47.92%、31.25%明显增加（P＜0.05）。见表3。

表1 各等位基因的基因平衡检验结果Table 1 Gene balance test results of each allele

表2 2组患者载脂蛋白E基因型和等位基因频率分布比较 ［n（%）］Table 2 Comparison of the frequency distribution of apolipoprotein E genotypes and alleles between the two groups ［n（%）］

表3 高血压脑出血患者认知功能障碍发生因素的单因素分析 ［n（%）］Table 3 Single factor analysis table of the occurrence factors of cognitive dysfunction in patients with hypertensive cerebral hemorrhage ［n（%）］

2.3 高血压脑出血患者认知功能障碍发生因素的多因素Logistic 回归分析 建立非条件Logistic 回归模型，以本研究资料为样本，以高血压脑出血患者认知功能障碍发生状况为应变量，赋值1=发生，0=否。以前述单因素分析表2 及表3 中等位基因频率分布比较中P＜0.10 的指标/因素为自变量。初选了ε2、ε3 携带及高血脂、血清亲环素A 等4 个指标作为自变量。并经统计和临床专家研判，认定该4 变量无较强共线交互作用。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。回归结果显示，血清亲环素A 浓度上升和携带ε4 等位基因是影响高血压脑出血患者发生认知功能障碍的独立危险因素（P＜0.05，OR＞1）。见表4。

表4 高血压脑出血患者认知功能障碍发生因素的多因素Logistic回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of the occurrence factors of cognitive dysfunction in patients with hypertensive cerebral hemorrhage

3 讨论

位于19号染色体长臂上的载脂蛋白E基因具有3种不同的等位基因，即ε2、ε3以及ε4［12］。多数研究表明，上述3 种基因中携带ε4 等位基因的患者体内会具有更高水平的低密度脂蛋白，增加发生动脉粥样硬化的风险，且加剧脑白质损伤，最终导致患者发生认知功能障碍［13-15］，给患者及其家属身心带来严重伤害。目前多数学者已从血脑屏障、动脉粥样硬化角度对高血压脑出血的发病机制进行了探讨［16-18］。最新研究已证实，血脑屏障的破坏是认知功能障碍的早期生物标记物，并与阿兹海默病的早期临床分期关系密切。载脂蛋白E4 作为阿尔兹海默症的主要易感基因，在血脑屏障破损以及脑血管周围细胞变性中起重要作用，通过与无载脂蛋白E4的个体进行对比发现，携带有载脂蛋白E4（具有ε3/ε3或ε3/ε4等位基因）的患者在海马和颞中叶区域存在明显的血脑屏障破损，但对于认知障碍是否更加严重未对比研究［7］。国外有学者通过动物实验发现，源自载脂蛋白E4（具有ε4/ε4 等位基因）的人类诱导的多能干细胞的周围细胞相比源自载脂蛋白E3（具有ε3/ε3等位基因）细胞周围细胞的亲环素A和金属蛋白酶9水平更高［19］。亲环素A 作为氧化应激诱导分泌的炎性因子，可有多种细胞，如单核细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等应对活性氧刺激而分泌产生，目前研究认为亲环素A 在动脉粥样硬化的发生中有重要作用，在不稳定斑块患者中可检出亲环素A 的高表达特点，有动物研究通过抑制亲环素A 在载脂蛋白E 缺损小鼠中的表达实现了减轻斑块局部炎症反应、减缓动脉粥样硬化进程的效果［20］，提示载脂蛋白E与亲环素A之间存在相互关系，而载脂蛋白E3可能通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1 转录抑制亲环素A 间接转录抑制金属蛋白酶9，成为影响认知功能障碍发生的关键。

本研究通过观察是否伴认知功能障碍患者载脂蛋白E不同等位基因表达特点发现，认知障碍组的3/4 基因型和ε4 等位基因占比显著高于非认知障碍（P＜0.05），认知障碍组3/3 基因型和ε3 等位基因占比显著低于非认知障碍组（P＜0.05）。可能原因是ε 4 等位基因和亲环素A 水平的变化在脂质斑块和动脉硬化的过程中都具有诱发作用，使得血管管腔直径缩小，甚至发生闭塞，从而导致高血压患者脑部血流供给不足，出现缺血性改变和深部灰质多发性腔隙性梗死灶，对额叶和丘脑皮质环路造成损害，最终导致高血压患者出现认知功能减退的症状，且以执行功能障碍为主［21-22］。2组患者的受教育年限、糖尿病发生率、吸烟率比较差异无统计学意义（P＞0.05），认知障碍组高血脂率、血清亲环素A＞180占比显著高于非认知障碍组（P＜0.05）。可能原因是作为亲环素家族的成员之一，亲环素A在调节免疫功能、折叠蛋白质、炎症反应以及胆固醇代谢过程中都具有重要参与作用，糖尿病肾病和冠心病等免疫类疾病和代谢类疾病都与亲环素A 具有密切关联［23-25］。本研究显示血清亲环素A浓度上升和携带ε4等位基因是影响高血压脑出血患者发生认知功能障碍的独立危险因素（P＜0.05），可能原因是亲环素A 属于前炎性因子，高血压脑出血患者体内血液流动异常，机体容易处于应激状态下，从而促进了血管平滑肌细胞和血管内皮细胞分泌亲环素A，而高水平亲环素A对于基质金属蛋白酶的活化具有促进作用［26］。基质金属蛋白酶对于血脑屏障的胶原蛋白Ⅳ、基膜蛋白具有降解作用，血脑屏障完整性因此被破坏，导致多种神经毒性物质能够直接被神经元摄取，大脑神经受到损害，最终表现为认知功能的下降［27-28］。同时携带ε4 等位基因的高血压患者对亲环素A-基质金属蛋白酶9 的途径具有激活作用，诱发损坏血脑屏障，认知功能出现障碍［17］。

血清亲环素A 水平的上升和ε4 等位基因携带促进了高血压脑出血患者出现认知功能障碍风险，对于病情进展也具有促进作用，二者是影响高血压脑出血患者发生认知功能障碍的独立危险因素，临床医务人员前期应注重对血清亲环素A和ε4等位基因的检测，能够为早期诊断提供部分依据。