流感疫苗毒种中3 种外源性禽病毒荧光定量PCR 检测方法的实验室间验证

王淑菁，付瑞，秦骁，刘朝阳，胡雅灵，王增，韩斌，王魁，岳秉飞

1.中国食品药品检定研究院，北京100050；2.上海生物制品研究所，上海201403；3.北京科兴生物制品有限公司，北京100085；4.华兰生物疫苗有限公司，河南新乡453000

疫苗生产过程中，不论是用胰酶进行细胞消化，还是用鸡胚传代培养，均存在外源性病毒污染的风险［1-2］。外源性病毒污染不仅影响疫苗的使用效果，且由于部分外源病毒的致病性，可能引起严重的生物安全问题［3-4］。降低潜在的外源病毒污染，保证疫苗的安全可靠是生物制品行业及管理部门的重要职责。《中国药典》三部（2015 版）中流感全病毒灭活疫苗及流感病毒裂解疫苗，均属鸡胚培养流感疫苗，规定这两种疫苗的种子批毒种需排除3 种外源性禽病毒［禽腺病毒Ⅰ型、Ⅲ型和禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）］污染［5］，禽腺病毒Ⅰ型即鸡胚致死孤儿病毒（chicken embryo lethal orphan virus，CELO）、禽腺病毒Ⅲ型即减蛋综合征病毒（egg drop syndrome virus，EDS）及 ALV 本身引起禽类的传染病并不严重，但往往引起鸡群隐性感染，并能垂直感染鸡胚，将给生物制品行业带来严重危害［6］。周斌等［7］使用电镜观察及PCR 扩增，发现鸭肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒中污染了高浓度的CELO。胡晓苗等［8］调查活毒疫苗中ALV 的污染情况，随机抽取国内外公司生产的的活毒疫苗，ALV 检出率为28.57%。《中国药典》三部（2015 版）规定的检测方法是将流感毒种中和后，在鸡胚成纤维细胞及鸡胚肝细胞上连传3 代培养，再进行血清学方法检测。现行方法检测周期长，至少需4 周；检测步骤繁琐，需制备原代鸡胚肝细胞。因此，急需建立快检方法，提高检测效率，缩短检测时间，以满足目前季节性流感疫苗批签发和应急检验的要求。

荧光定量PCR（Q-PCR）具有特异型强、灵敏度高、准确度好、快速等优点，是目前病毒检测的最适方法［9-11］。中国食品药品检定研究院（简称中检院）自开展外源性病毒检测工作以来，已建立了流感疫苗毒种中3 种外源性禽病毒的Q-PCR 检测方法。中检院作为方法建立实验室，组织3 家流感疫苗企业（上海生物制品研究所、北京科兴生物制品有限公司及华兰生物疫苗有限公司）为方法验证实验室，从方法的灵敏度、特异性、重复性、病毒污染模拟试验及盲样检测等方面，进行了实验室间验证。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病毒及载体 CELO、ALV 及小鼠腺病毒（mouse adenovirus，MAdV）均购自 ATCC（编号分别为 VR-432、VR-247 和 VR-550）；EDS 购自兽药监察所（编号：AV114）；小鼠白血病病毒由中检院实验动物质量检测室分离保存；H1N1、H3N2 及B 型流感毒种均为北京科兴生物制品有限公司送检留样样品，外源性禽病毒检测均为阴性，于-70 ℃保存；pMD19-T 载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 EASY Dilution（for Real Time PCR）、RNase-free Water、及 DNA ／ RNA 提取试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；Taqman DNA Expression Master Mix 及 ABI 7500 fast 型和 ABI 7500型Q-PCR 仪均购自美国ABI 公司。

1.3 质粒标准品的制备 分别以CELO 目的序列（GenBank：U46933.1）29 763 ～ 30 208 bp、EDS 目的序列（GenBank：Y09598.1）17 569 ～ 18 086 bp 及ALV 目的序列（GenBank：DQ365814.1）79 ～ 233 bp为模板，人工合成目的基因序列，克隆至pMD19-T载体中。质粒标准品由方法建立实验室统一制备完成，克隆阳性样品测序后，序列比对一致率为100%，质粒标准品制备成功。

1.4 Q-PCR 扩增 3 种外源性禽病毒的引物、探针均由上海英潍捷基公司合成，序列见表1。PCR 体系每个稀释度做3 个重复。反应体系为：Master Mix 10 μL，无 RNA 酶水 3.75 μL，引物探针混合液 1.25 μL（引物浓度为 4 μmol ／ L，探针浓度为 2 μmol ／ L），质粒DNA 或样品5 μL，反应总体系为20 μL。反应条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，共40 个循环。每个循环的延伸结束时检测荧光信号。

1.5 实验室间方法的验证

1.5.1 标准曲线的绘制 质粒标准品计算拷贝数后进行10 倍系列稀释，以不同稀释倍数（1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104及 1 × 103copies ／ μL）的质粒为模板进行Q-PCR 扩增。以病毒标准品浓度为横坐标，循环阈值（Ct）为纵坐标，绘制标准曲线。曲线参数合格标准：Slope 在-3 ～ -3.5 之间、R2＞ 0.99、扩增效率（Eff）为90% ～110%。按下式计算质粒标准品拷贝数。

拷贝数（copies ／ μL）=（6.02 × 1023）× 10-9（ng ／ μL）／（DNA length × 2 × 320）

1.5.2 灵敏度 将质粒标准品稀释至1 × 108～1 ×100copies ／ μL，每个样品检测 3 次。

表1 3 种外源性禽病毒的引物、探针序列Tab.1 Primers and probes of three extraneous avian viruses

1.5.3 特异性 CELO 选择 EDS、MAdV、流感病毒H3N2 及流感病毒B 型为特异性验证对照；EDS 选择CELO、MAdV、流感病毒H3N2 及流感病毒B 型为特异性验证对照；ALV 选择小鼠白血病病毒、流感病毒H3N2 及流感病毒B 型为特异性验证对照。每个样品3 个重复。

1.5.4 重复性 分别对 CELO、EDS 及 ALV 的 1 ×105和 1 × 104copies ／ μL 质粒进行试验内及试验间的检测，试验重复3 次。计算试验内及试验间拷贝数和Ct 的CV。

1.5.5 病毒污染模拟试验 将CELO、EDS 及ALV分别用PBS 从1 × 100开始进行倍比稀释。取不同浓度梯度的病毒，分别掺入10% H1N1 流感病毒后进行Q-PCR 检测，模拟外源性禽病毒污染。CELO及EDS 掺入流感病毒的浓度梯度均为1 × 10-1～1 × 10-8；ALV 掺入流感病毒的浓度梯度为 1 × 10-1～1 × 10-6。

1.5.6 盲样检测 将CELO、EDS 及ALV 随机掺入H1N1 流感病毒中，发给3 家方法验证实验室进行外源性禽源病毒检测，共12 个盲样。盲样1 ～4 含CELO；盲样 5 ～ 8 含 EDS；盲样 9 ～ 12 含 ALV。

2 结 果

2.1 CELO 结果显示，4 家实验室的标准曲线参数、灵敏度、特异性、重复性、病毒污染模拟试验及盲样检测结果均一致。标准曲线参数Slope 在-3.250 ～-3.495 之间，R2值为 0.993 ～ 1，Eff 为 93.263% ～103.105%，均符合定量检测的要求；灵敏度均达1 ×100copies ／ μL；特异性仅 CELO 检出，其他病毒均未检出；试验内及试验间的CV 为0.02% ～10.66%，均小于15%；检出CELO 病毒掺入最低检测限均为1 × 10-7，拷贝数为 15 ～ 23.16 copies ／ μL；盲样 4 均为阳性样品，盲样1 ～3 均为阴性样品。见表2。

2.2 EDS 结果显示，标准曲线参数：4 家实验室Slope 在-3.368 ～ -3.471 之间，R2为 0.997 ～ 1，Eff为94.119% ～98.129%，均符合定量检测要求；灵敏度：方法建立实验室灵敏度为 1 × 101copies ／ μL，3 家方法验证实验室灵敏度均为 1 × 100copies ／ μL；特异性：4 家实验室结果均一致，仅EDS 检出，其他病毒均未检出；重复性：4 家实验室试验内及试验间的CV 为0.09% ～9.83%，均小于10%；病毒污染模拟试验：方法建立实验室及2 家方法验证实验室检出EDS 病毒掺入最低检测限均为1 × 10-5，拷贝数为 12.7 ～ 73.72 copies ／ μL，1 家方法验证实验室检出病毒掺入最低检测限为1 × 10-4，拷贝数为47.98 copies ／ μL；盲样检测：4 家实验室结果均一致，盲样6 均为阳性样品，盲样5、7 及8 均为阴性样品。见表3。

2.3 ALV 结果显示，标准曲线参数：4 家实验室Slope在-3.325 ～ -3.449 之间，R2为 0.997 ～ 1，Eff 为94.961%～99.876%，均符合定量检测要求；灵敏度：方法建立实验室及2 家方法验证实验室灵敏度均为1 × 101copies ／ μL，1 家方法验证室灵敏度为 1 ×100copies ／ μL；特异性：4 家实验室结果均一致，仅ALV 检出，其他病毒均未检出；重复性：4 家实验室试验内及试验间的CV 为0.00% ～9.63%，均小于10%；病毒污染模拟试验，方法建立实验室及2 家方法验证实验室检出ALV 掺入最低检测限为1 ×10-4，拷贝数为 12.24 ～ 34.3 copies ／ μL，1 家方法验证实验室检出病毒掺入最低检测限为1 × 10-3，拷贝数为 352 copies ／ μL；盲样检测：4 家实验室结果均一致，盲样11 及12 为阳性样品，盲样9 及10 均为阴性样品。见表4。

表2 CELO 实验室间验证Tab.2 Interlaboratory verification results of CELO

表3 EDS 实验室间验证结果Tab.3 Interlaboratory verification results of EDS

表4 ALV 实验室间验证结果Tab.4 Interlaboratory verification results of ALV

3 讨 论

CELO、EDS 及 ALV 的 Q-PCR 方法验证中，各实验室间在标准曲线参数、特异性、重复性及盲样检测方面均得到一致性结果。标准曲线参数均满足Slope 在-3 ～ -3.5 之间、R2＞ 0.99、Eff 为 90% ～110%的要求；仅特异性病毒出现扩增曲线，其他病毒无扩增曲线出现；试验内及试验间Ct 和拷贝数的CV 均 ＜ 15%。

在检测EDS 及ALV 方法的灵敏度及病毒污染模拟试验中，实验室间出现不一致的结果。方法建立实验室检测 EDS 的灵敏度为 1 × 101copies ／ μL，3 家方法验证实验室灵敏度均为1×100copies ／μL；在病毒污染模拟试验中，方法建立实验室及2 家方法验证实验室检测ALV 最低检测限为1 × 10-4病毒掺入，1 家方法验证实验室为1 × 10-3。不同实验室间出现1 个数量级的差异，提示由于人员操作、仪器精密度等原因造成了不同实验室间方法灵敏度的不同，而实验室间方法验证的意义也在于此，尽可能考察方法的各个环节，并设定合理的检测流程及判定标准。在进行方法的灵敏度限定时，应选择4家实验室均能检出的检测限值作为判定标准。

WHO 及《欧洲药典》9.8 均规定鸡胚培养流感疫苗生产中应进行病毒去除／ 灭活工艺验证，确保无外源性病毒污染的风险。如无法进行病毒去除／ 灭活工艺验证，则需对流感病毒种子批毒种及单价液均进行外源性禽病毒检测，并推荐使用快速检测方法，如PCR 方法，但未列出特异性引物或探针［12-13］。

中检院实验动物质量检测室建立了3 种外源性禽病毒Q-PCR 方法，并从标准曲线参数、灵敏度、特异性、重复性、病毒污染模拟试验、盲样检测方面开展实验室间验证，获得了一致性结果，结果表明，3种外源性禽病毒Q-PCR 检测方法具有良好的灵敏度、特异性、重复性，可用于流感疫苗毒种外源性禽病毒的快速检测，为该快检方法的进一步推广应用提供了数据支撑。