基于网络药理学研究桃仁-红花治疗高脂血症的作用机制*

崔金鹏，李淑洲，王佐梅，李雪莹，姚欣卉，苗金雪，肖洪彬

黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

桃仁是蔷薇科植物桃Prunuspersica(L.)Batsch或山桃Prunusdavidiana(Carr.)Franch的干燥成熟种子，其味甘、苦，性平，行血活血之药也，而其活血之性缓。《神农本草经》云：“主瘀血”，《名医别录》曰“破癥瘕”。红花是菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，其味辛性温，入心肝二经，可逐腹中恶血而补血虚。血瘀证是由于血液循环障碍而造成的全身或局部组织器官供血供氧不足，引起组织的炎症、增生、坏死、血栓、出血等。中医学认为肝主疏泄、肝藏血。肝通过疏泄功能调畅气机，气机逆乱，则清浊混淆，津血败坏为痰浊瘀血，痰浊瘀血壅塞于脉络之间，影响津血的正常运行，致使血液发生浓、黏、凝、聚的异常变化，诱发非酒精性脂肪肝[1]、脑梗死[2]、冠状动脉粥样硬化性心脏病[3]和心肌梗死[4]等，以上是高脂血症形成的原因之一。王微[5]、马贵萍[6]、曾定伦[7]、王臬[8]等医家都对高脂血症痰浊血瘀型进行过论述。高脂血症是体内脂质代谢紊乱引起的血脂水平增高的一种全身性疾病，严重威胁着人类健康。高脂血症属于西医病名，其论述散见于胸痹、中风、痰湿、浊阻等病中，现代中医将其归属于传统中医学的痰浊、血瘀范畴[9]。痰浊和血瘀的高脂血症的主要病理产物，痰瘀互结证也是高脂血症的常见证型[10]。由于中药多成分、多靶点、多途径协同作用，使中药作用机制难以明确。近年来通过对疾病基因网络和药物作用网络的分析研究发现，药物不仅作用于多个靶点，同时靶点也作用于多种疾病，因此就形成了复杂的药物-靶点-疾病的复杂网络。网络药理学是将系统科学、网络科学、生物信息学、计算机科学和数学等多学科融合，通过数据收集、靶点预测、网络分析与可视化、多组分相互作用和信号通路预测，使多靶点药物分子设计更为精确，从而提高应用基础研究的成功率。网络药理学的发展与应用，将会对疾病特别是复杂疾病发病机制的全面了解，以及治疗药物的发现和研究做出贡献。所以本研究通过网络药理学方法分析桃仁-红花治疗高脂血症的作用，为中西医结合治疗高脂血症提供新的研究思路，同时为活血化瘀降脂药的研究提供参考依据。

1 方法

1.1 高脂血症相关作用靶点收集在Drugbank疾病靶点数据库和TTD(therapetutic target datebase)疾病靶点数据库输入疾病名称“Hyperlipidemia”“Hyperlipemia”检索高脂血症的作用靶点，运用Uniprot数据库获得人源Uniprot ID，以供后续分析。

1.2 桃仁-红花活性成分的收集及靶点预测运用中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库检索桃仁、红花化学成分，共获得化学成分255个，其中桃仁66个、红花189个，考虑中药在体内吸收、分布、代谢、排泄后作用靶点器官及数据量，设置口服药物利用度(drug-like，OB)≥30%、类药性(oral bioavailability,DL)≥0.18、化合物的半衰期(half-life，HL)≥4。运用TCMSP数据库获得活性成分预测靶点，应用Uniprot数据库获得人源Uniprot ID。

1.3 构建桃仁-红花活性成分-潜在靶点网络将药物预测的靶点与高脂血症作用靶点运用VENNY 2.1数据库筛选共同靶点，运用Cytoscape3.7.1软件绘制桃仁-红花活性成分-潜在靶点网络。

1.4 潜在靶点生物学过程及通路分析使用Cytoscape插件ClueGO对16个潜在靶点基因进行GO(gene ontology)生物学过程富集分析和KEGG(kyoto encylopedia of genes and genomes)通路富集分析，选取具有显著性差异的生物学过程和通路。

2 结果

2.1 高脂血症靶点收集基于TTD、Drugbank数据库挖掘并删除重复靶点，将靶点信息导入Uniprot数据库获取人源基因，得到高脂血症47个作用靶点(表1)。

2.2 桃仁-红花活性成分及预测靶点经TCMSP数据库检索并设置OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4，获得桃仁活性成分23个，红花活性成分16个，去除无明确作用靶点及靶点无人源基因的活性成分后，获得32个活性成分(包含1个共有成分)(表2)。对筛选后的化合物成分进行分析，桃仁化合物成分主要有黄酮及其苷类、甾体和萜类、酚酸类等，且《中国药典》将苦杏仁苷作为控制桃仁药材的指标性成分。

2.3 桃仁-红花活性成分-潜在靶点网络构建与分析应用TCMSP数据库获得活性成分预测靶点564个，其中桃仁133个、红花431个。运用VENNY 2.1数据库筛选桃仁-红花预测靶点和高脂血症作用靶点，获得16个靶点，即ESR1、PPARG、CASP3、CYP3A4、ALB、SLC6A4、TNF、SLC6A2、INSR、AKR1C3、SLC6A3、MAOB、MAOA、ABCG2、PPARA、PPARD。推测桃仁-红花活性成分主要通过对16个潜在靶点的作用治疗高脂血症。应用Cytoscape3.7.1构建桃仁-红花活性成分-潜在靶点网络(图1)。其网络中共包括29个节点(13个活性成分节和16个潜在靶点节点)，组成41条活性成分-潜在靶点联系，充分体现了中药多成分、多靶点相互作用的复杂网络关系，验证了桃仁-红花对高脂血症治疗是通过多途径、多靶点、整体协同方式发挥作用的。经过Network Analyzer对网络中节点进行分析，桃仁-红花活性成分-潜在靶点网络中靶点平均节点度为2.6，共有7个靶点蛋白Degree≥3，分别是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARG)、钠依赖去甲肾上腺素转运体(SLC6A2)、钠依赖5-羟色胺转运体(SLC6A4)、细胞色素P450(CYP3A4)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素受体(INSR)，即以上靶蛋白是桃仁-红花活性成分发挥治疗高脂血症的关键靶点。

表1 桃仁-红花47个与高脂血症相关靶点

表2 桃仁-红花活性成分基本信息

2.4 桃仁-红花治疗高脂血症的潜在靶点GO基因功能富集分析富集分析共得到22条P≤0.05的生物过程，结果分为3部分，富集分析网络图、富集分析饼状图、柱状图。依据P值越小可靠性越高，排名前10位的生物学过程依次为dopamine catabolic process(多巴胺的分解过程)、catechol-containing compound catabolic process(含儿茶酚的化合物分解代谢过程)、catecholamine catabolic process(儿茶酚胺分解过程)、phenol-containing compound catabolic process(含酚化合物分解代谢过程)、response to nicotine(对尼古丁反应)、sequestering of triglyceride(甘油三酸酯隔绝)、organic hydroxy compound catabolic process(有机羟基化合物分解代谢过程)、dopamine uptake(多巴胺吸收)、monoamine transport(单胺运输)、catecholamine uptake(儿茶酚胺吸收)。这些生物学过程表明高脂血症相关靶点偏于通过调节靶基因转录、蛋白水解、神经递质转运的方式，从而促进高脂血症的发生和发展。

图1 桃仁-红花活性成分-潜在靶点网络

图2 桃仁-红花治疗高脂血症的潜在靶点GO基因功能富集分析

表3 桃仁-红花治疗高脂血症潜在靶点生物学过程的GO分析

图3 桃仁-红花治疗高脂血症的潜在靶点KEGG通路富集分析

2.5 桃仁-红花治疗高脂血症的潜在靶点KEGG通路富集分析共得到4条P≤0.05的通路，PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)、药物代谢(drug metabolism)、可卡因成瘾(cocaine addiction)、安非他明成瘾(amphetamine addiction)。

表4 桃仁-红花治疗高脂血症的潜在靶点通路

3 讨论

高脂血症是体内脂质代谢紊乱引起的血脂水平增高而产生的一种全身性疾病，易诱发多种疾病及并发症。研究表明，高脂血症与脑血栓、心肌梗死、心脏猝死、糖尿病、高血压、脂肪肝等有密切的关系，是形成冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要危险因素之一。随着生活水平的提高及饮食习惯的改变，高脂血症的潜在人群不断增加，已逐渐成为威胁人类健康的重要因素之一。高脂血症受多种因素的共同影响，多信号分子参与其发生发展，使得对高脂血症的细胞内信号的转输做出正确的预测。本研究通过网络药理学方法，筛选桃仁-红花中的活性成分及预测靶点，获取高脂血症治疗靶点，映射出桃仁-红花治疗高脂血症的网络图，从系统上研究药物对人体之间的相互作用及规律，并且确定分子层面的靶点、生物学过程、通路等，阐释桃仁-红花治疗高脂血症的效应机制。通过对高脂血症治疗靶点与桃仁-红花活性成分的预测靶点对比，获得16个对高脂血症有明确治疗意义的靶点，其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ、钠依赖去甲肾上腺素转运体钠依赖5-羟色胺转运体、细胞色素P450、肿瘤坏死因子、胰岛素受体被视为桃仁-红花治疗高脂血症的重要靶点。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ控制着脂肪酸的过氧化物酶体β氧化途径是脂肪细胞分化的关键调节因子。降低 PPAR-γ 的表达能够抑制脂肪肝的发生[11]、脂肪细胞分化[12]、脂肪细胞分泌的Adiponectin、Leptin，有效地抑制BMMSCs向脂肪细胞的过度分化[13]、非酒精性脂肪肝病中脂代谢[14]。钠依赖去甲肾上腺素转运体是单胺转运体。去甲肾上腺素通过其高亲和力的钠依赖性再摄取到突触前终末而终止其作用[15]。伍菲凡[16]研究发现，高脂饮食小鼠的五羟色胺浓度会显著降低。胰岛素受体是介导胰岛素多向作用的受体酪氨酸激酶，胰岛素结合可导致多种细胞内底物磷酸化。增加胰岛素受体底物的基因表达，可能是治疗肥胖的作用机制之一，增强胰岛素受体底物活性可改善非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素抵抗[17]。相关实验表明[18-19]，非酒精性脂肪性肝病血清肿瘤坏死因子-α明显上升，给予药物后患者血清脂质指标改善同时，肿瘤坏死因子-α水平显著降低。对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3靶点对治疗高脂血症研究相对较少，可做深入研究。通过对潜在靶点的GO和KEGG富集分析结果说明，高脂血症主要与药物代谢、PPAR信号通路最为相关。欧丽娜等[19]通过研究发现，具有雌激素样作用的补肾阳药可调节脂代谢，胆固醇逆向转运关键蛋白介导药物可调控脂代谢[20]。PPAR信号通路已经通过关键靶点过氧化物酶体增殖物激活受体-γ在通路中起到的作用验证了通路的可靠性。

本研究应用网络药理学方法对桃仁-红花治疗高脂血症的活性成分、作用靶点和作用机制进行了初步探索，为进一步研究活血化瘀降脂药提供参考和依据。