水霉病对草鱼血液生化指标和肌肉泛素-蛋白酶体系统的影响

许娜，刘馨璐，刘璐，汤蓉，李大鹏

(华中农业大学水产学院， 长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，水产养殖国家级实验教学示范中心， 池塘健康养殖湖北省工程实验室， 湖北 武汉 430070)

养殖鱼类在捕捞、运输或接触不良环境胁迫时容易受到损伤，可能诱发竖鳞病、赤皮病及水霉病等疾病，严重影响水产养殖的经济效益。水霉病是一种常见真菌性疾病[1]。在鱼类体表鳞片脱落等受伤情况下，病菌入侵伤口并向外生长，致使病变部位体表附着棉絮状灰白色菌丝，导致组织发炎、坏死，并最终致其死亡[2]。

血液中的葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)以及乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)等，作为常见的鱼类血液生化指标，其含量水平和酶活水平可以反映出机体物质代谢和能量代谢的基本情况，机体发生的生理或病理变化也可通过血液生化指标的变化反映出来[3-4]。目前鱼类血液生化指标的标准尚未统一，但不少研究结果显示鱼类养殖环境、营养条件的改变以及感染疾病都会引起血液生化指标发生显著变化。高密度养殖导致团头鲂(Megalobramaamblycephala)血清总蛋白(TP)和TG等含量显著增加，以应对拥挤胁迫时机体对能量的需求[5]。史氏鲟(Acipenserschrenckii)饥饿3 d 后血浆TG和CHO浓度显著增高，提示在食物剥夺期间鱼体脂质代谢增强[6]。大西洋鲑(Salmosalar)感染冷水弧菌病的血清TP、白蛋白(ALB)、TG和CHO均显著降低，而ALT活性显著升高，表明肝细胞功能不全，阻碍物质代谢[7]。大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)患哈维氏弧菌病后血清ALT和AST含量显著增加，表明鱼体在病原菌作用下肝脏组织受损，引起血清酶含量迅速上升[8]。因此，鱼类血液生化指标是鱼类研究中评估其状态的重要参考指标。

生物和非生物条件的变化是水产养殖中常见的应激因素，会引起机体蛋白质代谢的动态变化[9-10]。热休克蛋白(HSP)又称为应激蛋白，通常被认为是细胞应激反应的生物标志物[11]。细胞应激引起细胞蛋白质发生错误折叠，若受损蛋白质不及时降解，将积累形成对细胞有害的聚集体，干扰细胞正常功能[12]。HSPs可作为分子伴侣参与受损蛋白质的修复，一旦无法修复，泛素连接酶(CHIP)将介导泛素化HSPs标记的伴侣蛋白底物，激活泛素-蛋白酶体系统(UPS)，诱导受损蛋白的降解，维持细胞内蛋白质的代谢稳态，保持细胞的完整性以发挥其正常功能[13-16]。UPS是真核细胞内调节蛋白质降解的主要承担者，细胞内衰老、损伤或错误折叠的蛋白质都可通过此途径被降解[17]。该系统由泛素(ub)、泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)及26S蛋白酶体等组成[18]。UPS降解蛋白质一般是通过多个泛素分子在E1、E2和E3的作用下与目标底物蛋白结合，形成一条多聚泛素链，进而被26S蛋白酶体识别，降解为小肽或氨基酸[19]。

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是中国水产养殖产量排名第一的鱼类，年产量超过550万 t[20]。草鱼对外界环境变化较为敏感，鱼体受伤较易感染水霉病。本研究对比分析感染水霉病和健康草鱼血液生化指标和肌肉泛素-蛋白酶体系统活性，进而探讨水霉病对草鱼生理机能和骨骼肌蛋白质降解情况的影响。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

试验草鱼(93.55±2.99) g购自湖北省黄冈市团风县百容良种场，养殖于华中农业大学水产学院教学实习基地。水温为20～23 ℃，pH为(8.06±0.02)，溶解氧为(6.55±0.08) mg/L。养殖期间发现有的草鱼体表附着灰白色絮状物，用手术镊取其置于培养皿中，70%乙醇处理后通过显微镜观察，可见管状菌丝，有分枝但无分隔，菌丝梢端膨大，释放的动孢子呈梨形，具两条等长的前鞭毛，以此确定为水霉科，水霉属(Saprolegnia)。随机选取10尾感染水霉病的草鱼(体表肉眼可见附着厚重水霉，处于患病后期)作为患病组，体重为(91.21±4.51) g，体长为(17.71±0.29) cm；另于无水霉感染养殖缸中挑选10尾体表鳞片完整，无损伤无出血的健康草鱼作为对照组，体重为(95.89±4.04) g，体长为(18.22±0.24) cm。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集

采用MS-222(间氨基苯甲酸乙酯，200 mg/L)进行鱼体麻醉，尾动脉采血，室温静置分层后3 000 r/min离心30 min分离血清，-80 ℃保存用于血液生化指标的测定。采集草鱼背部白肌液氮速冻后置于-80 ℃冰箱中用于基因和蛋白相对定量表达分析。

1.2.2 血液生化指标测定

葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)在Selectra XL型全自动生化分析仪(荷兰威图科学公司)上测定。试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司(批号依次分别为193681、180531、170631、182041、187881、181371、192711、190651和190681)。

1.2.3 泛素-蛋白酶体系统相关基因表达水平检测

使用总RNA提取试剂盒(武汉科尔普生物科技有限公司，批号130318)提取背部肌肉总RNA；使用Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR (gDNA digester plus) 试剂盒(YEASEN，批号H1816441)进行逆转录；使用HieffTMqPCR SYBR®Green Master Mix (Low Rox Plus) 试剂盒(YEASEN，批号H3901010)并在Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR Detection System (Applied Biosystems，USA)上进行荧光定量反应。引物序列(表1)及实验方法参考本实验室已发表文章[21]。

1.2.4 泛素化蛋白含量的测定

使用Dot-blot方法测定草鱼背部肌肉泛素化蛋白含量。肌肉总蛋白提取使用RIPA裂解缓冲液(广州捷倍斯生物科技有限公司，批号1707GB010)，浓度由BCA蛋白试剂盒测定(广州捷倍斯生物科技有限公司，批号1911BCA011)，通过Odyssey CLx (LI-COR, CLx-0813)显影分析, 使用Image J读取各斑点灰度值, 进行相对定量分析[21]。

1.3 数据分析

基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算，使用SPSS 17.0软件对数据进行独立样本t-检验分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。所得数据以平均值±标准误(Mean±SEM)表示，使用Graphpad Prism.V 5.0作图。

2 结果

2.1 感染水霉病对草鱼血液生化指标的影响

患病组与对照组草鱼的血液生化指标测定结果见表2。与对照组相比，患病组草鱼的血清CHO、ALB、TP和TG浓度分别下降了22.69%、28.17%、25.56%和17.89%(P<0.05)，GLU浓度有下降趋势但无统计学意义。患病组草鱼血清AST和LDH活性分别是对照组的2.02和1.97倍(P<0.05)，但ALP和ALT活性在两组间没有显著性差异。

表1 荧光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

表2 患病组和对照组草鱼的血液生化指标Tab.2 Blood biochemical indices of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group

2.2 感染水霉病对草鱼肌肉nrf2和hsp基因表达的影响

水霉病感染显著上调草鱼的nrf2和hsp基因表达。

患病组草鱼肌肉nrf2 mRNA表达水平是对照组的6.56倍，hsp70 mRNA表达水平是对照组的6.21倍，hsp90 mRNA表达水平是对照组的2.61倍(P<0.01，图1)。

图1 患病组和对照组草鱼nrf2、hsp70、hsp90的相对表达量“**”表示组间差异极显著(P < 0.01)。下同。Fig.1 Relative expressions of nrf2, hsp70 and hsp90 of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group“**” indicate extremely significant differences among groups(P<0.01).The same below.

2.3 感染水霉病对草鱼肌肉泛素-蛋白酶体系统的影响

感染水霉病引起草鱼肌肉UPS相关基因表达量和蛋白含量的改变。与对照组相比，患病组草鱼肌肉中chip、ub、psma2、psmc1、murf1和mafbx的mRNA表达量皆显著上调，分别是对照组的1.57、5.15、7.98、4.70、11.98和3.36倍(P<0.01，图2)。患病组草鱼肌肉中泛素化蛋白含量较对照组也显著性增加(P<0.05，图3)。

图2 患病组和对照组草鱼肌肉UPS相关基因的相对表达量Fig.2 Relative expressions of genes related to UPS of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group

图3 患病组和对照组草鱼肌肉泛素化蛋白的相对含量“*”表示组间差异显著(P<0.05)。Fig.3 Relative content of ubiquitinated protein of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group“*” indicate significant differences among groups(P<0.05).

3 讨论

CHO主要在肝脏中合成，是碳水化合物、脂质和蛋白质代谢的主要降解产物和指标，肝脏也是合成TG和TP的主要器官，因此血清蛋白质、胆固醇等物质含量与肝脏功能密切相关，其在血清中的含量变化可表示肝功能的好坏[22]。研究显示鱼类感染疾病后期血清TP、CHO、TG和ALB等生化指标呈下降趋势。余银春等[23]发现感染嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)的乌鳢(Channaargus)血清TP、CHO浓度显著下降，间接表明鱼体的肝脏组织发生病变。类似的结果在张书环[24]和本研究中也被发现，说明感染疾病使鱼类肝脏受损，合成能力下降，导致血清CHO、TP和TG等物质含量减少。美洲红点鲑(Salvelinusfontinalis)感染柱状黄杆菌(Flavobacteriumcloumnare)后血清TP和ALB浓度降低，可能是由于急性免疫过程中蛋白质分解代谢增加或肝脏病变导致蛋白质合成减少所致[25]。本研究发现水霉菌感染也显著降低草鱼血清ALB和TP含量。机体在病原入侵后启动免疫防御机制，白蛋白可作为载体对病原进行清除而被迅速消耗[26]。感染疾病后机体分解代谢的增加以及食物摄入的减少可能也是血清蛋白含量降低的原因[25]。

ALT和AST主要分布于肝、肾和肌肉等组织器官的细胞中，正常情况下在血清中保持低水平且相对稳定的酶活，当肝脏等组织受到损伤或胁迫时，血液中这两种酶活将升高，因此二者是肝脏等组织器官受损的重要指示酶[22]。研究发现，水霉菌感染的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[27]和鲤(Cyprinuscarpio)[28]的肝脏、脾脏和肾脏3种组织均有不同程度的损伤，洋葱霍尔德氏菌(Burkholcepacid)感染的加州鲈(Micropterussalmoides)[29]、柱状黄杆菌感染的黄颡鱼(Ruditapesphilippinarum)[30]以及水霉菌感染的草鱼血清中AST活性皆显著上升，说明感染疾病损伤机体肝肾等组织器官，细胞内酶大量逸出，导致血清酶活性显著增强。LDH在横纹肌细胞内含量最高，其在血清中的含量变化与鱼体肌肉组织的健康状况有关[31]。气单胞菌(Aeromonas)感染或病毒性出血性败血症引起虹鳟皮肤发生病变或肌肉出现条纹状或瘀点性出血，伴随着血清LDH活性增长[32-33]。本试验中患病组草鱼LDH活性显著增强，表明其肌肉组织受损，阻碍肌肉代谢，这与草鱼感染处体表的鳞片皮肤溃烂直见肌肉的现象相吻合。ALP是一种重要的代谢调控酶，在鱼类非特异性免疫方面具有重要作用，有助于提高鱼的抗病力[34]。研究未发现累枝虫(Epistylisunioi)寄生的黄颡鱼[35]和水霉菌感染的草鱼血清ALP活性有显著变化，说明患病鱼非特异性免疫能力下降，抗病能力减弱。

黄建等[28]研究发现，感染水霉病的鲤组织细胞内氧化水平-抗氧化水平失衡，鱼体产生氧化应激，破坏细胞的正常生理功能，导致组织损伤。核因子E2相关因子2(Nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)是机体对抗氧化应激最重要的内源性信号通路，Nrf2是机体在应对氧化应激时启动细胞防御体系的关键调控因子[36]。研究表明，氧化应激激活Nrf2，并启动下游蛋白酶体/分子伴侣类基因的转录和表达以抵抗有害刺激[37]。黑头软口鲦(Pimephalespromelas)感染鲤春病毒血症病毒(infection with spring viraemia of carp virus，SVCV)后上皮瘤细胞Nrf2的基因转录水平和蛋白表达量均显著增加[38]，草鱼在48 h的急性拥挤胁迫后肌肉nrf2和hsp70 mRNA表达显著上调[39]，细胞应激反应被诱导。而草鱼在70 d的慢性拥挤胁迫后，肌肉的nrf2和hsp90 mRNA表达水平没有发生变化，说明鱼体适应了胁迫环境，应激反应不显著[21]。本试验发现，感染水霉病草鱼的肌肉nrf2、hsp70和hsp90 mRNA水平均显著高于对照组，说明细胞产生应激反应，发生了氧化应激，Nrf2调控因子被激活以启动细胞防御体系，增强机体抵抗氧化应激反应的能力，并上调分子伴侣HSP基因的转录和表达以协调受损蛋白质的降解。

目前普遍认为氧化应激造成蛋白质合成与降解失衡，进而导致肌肉萎缩[40]。在应激条件下，细胞蛋白质发生错误折叠，当HSP作为分子伴侣重折叠不成功时，受损蛋白质由泛素连接酶CHIP呈递给UPS降解[14-15]。研究发现，比目鱼(Pleuronectiformes)[41]和草鱼[39]在拥挤胁迫后，骨骼肌中UPS相关基因的表达量和泛素化蛋白质的含量皆显著上调。在本研究中，感染水霉病也引起草鱼肌肉ub等UPS相关基因表达量的显著上升和泛素化蛋白质的高表达，表明生理和病理应激条件下都能激活UPS，造成泛素化蛋白质的积累。UPS被激活以调节蛋白质合成和降解过程的动态平衡，维持细胞蛋白质稳态[17]，失衡则会造成机体损伤。泛素连接酶MAFbx和MuRF1的基因表达水平可以作为骨骼肌蛋白质降解的分子标记物，在肌肉相关疾病的诊断中起到辅助作用[42]。感染水霉病草鱼的murf1和mafbxmRNA水平的高表达说明骨骼肌蛋白质降解被增强，最终可能导致肌肉萎缩。

综上所述，水霉菌感染造成草鱼血清酶活性增强，白蛋白、总蛋白和胆固醇等物质含量降低，引起机体产生应激反应，激活骨骼肌泛素-蛋白酶体系统，提高了蛋白质降解速率。本研究关于血液生化指标和肌肉UPS活性变化的研究，将有助于更深入地了解水霉病对草鱼生理状态的影响，为水霉病的诊断和防治提供科学的参考依据。