QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定鲤肝脏中氟虫腈及其代谢物残留

马丽莎，单奇，谢文平，尹怡，刘书贵，李丽春，赵成，郑光明

(中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(广州)，农业农村部休闲渔业重点实验室， 广东 广州 510380)

氟虫腈(fipronil)是苯基吡唑类新型高活性杀虫剂，可阻碍昆虫γ-氨基丁酸控制的氯化物代谢[1]，被广泛用于水稻等多种经济作物的虫害防治中[2]。但氟虫腈及其代谢产物氟甲腈(fipronil desulfinyl)、氟虫腈亚砜(fipronil sulfide)和氟虫腈砜(fipronil sulfone)等具有高毒、高残留及“三致”(致畸、致癌、致突变)等副作用[3-5]，目前已被欧盟禁止用于人类食品产业链的畜禽养殖过程，中国也限制了氟虫腈的销售和使用[6]。由于氟虫腈具有杀虫效果好、价格低廉等优点，生产实践中仍存在违规使用的问题，欧盟食品和饲料快速报警系统[7]显示,近年来中国出口茶叶曾多次因氟虫腈农残超标被通报, 2017年欧盟爆发的“毒鸡蛋”事件更将食品中氟虫腈及其代谢物残留问题推上了食品安全的风口浪尖。

鉴于残留在环境中的氟虫腈半衰期长[8]且极难降解[9]，而水产养殖又为环境依赖型产业[10]，因此中国水产品可能存在氟虫腈污染的潜在风险，浙江沿海海产品[11]中有检出氟虫腈及其代谢物残留的报道。而残留是影响食品安全的重要因素，药物代谢与残留消除规律研究是避免残留的科技基础，肝脏是体内药物代谢的重要场所，故建立鲤(Cyprinuscarpio)肝脏中氟虫腈及其代谢物残留的检测方法，有助于进一步开展鲤肝脏中氟虫腈药物代谢及残留消除规律的研究。

目前，氟虫腈及其代谢物的测定方法较多，包括液相色谱(LC)[12]、气相色谱(GC)[13-14]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS)[15-16]等。液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)因灵敏度高、抗干扰能力强的优点被广泛应用于氟虫腈及其代谢物的测定[17-19]，而这些方法主要针对的是陆生动物源性食品、蔬菜水果及鸡蛋等食品中氟虫腈及其代谢物残留检测，Zhang等[11]建立了测定海产品中氟虫腈及其代谢物残留的UHPLC-MS/MS法，但仅适用于水产品肌肉中的检测，尚无鱼肝脏中氟虫腈及其代谢物残留检测方法的报道。QuEChERS具有快速、简单、高效及价廉等优点，被广泛用于水产品中药物残留的检测[20-22]。本研究改进了QuEChERS提取净化方法，并利用液相色谱串联质谱定量分析灵敏度高的优势，建立了QuEChERS-液相色谱串联质谱法测定鲤肝脏中的氟虫腈及其代谢物残留，该方法准确、快速、耗溶剂少且成本低，单个样品前处理时间仅需20 min，可实现样品的批量化处理，可为鲤肝脏中氟虫腈药物代谢及残留消除规律的研究提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 6470 三重四极杆液质联用仪，美国Agilent科技公司；IKA MS3 basic涡旋振荡仪，德国IKA公司；TDL-5-A飞鸽牌离心机，中国上海安亭公司；高速离心机，美国Sigma公司；Milli-Q去离子水发生器，美国Millipore公司；玻璃匀浆器，南京奥多福尼生物科技有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA 40～60目)、石墨化炭黑(GCB)及中性氧化铝(Alumina-N)，美国Agela公司；无水硫酸钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司，500 ℃灼烧4 h,冷却后储存于磨口玻璃瓶中备用。

氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜和氟虫腈砜标准物质，纯度均大于99 %，德国Dr．Ehrenstorfor 公司；乙腈、甲酸、正己烷，均为色谱纯，美国霍尼韦尔公司；实验用水为Milii-Q去离子水。

1.2 溶液的配制

1.2.1 标准储备液的配制

分别称取适量的标准物质，用乙腈溶解，配制成1.0 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃避光保存。

1.2.2 混合标准溶液的配制

分别移取适量的标准储备液，用乙腈配制成10 μg/mL的混合标准溶液，于-18 ℃避光保存。

1.2.3 空白基质提取液

样品按照1.3节条件前处理后上机检测，当4种目标物的定性与定量离子信噪比均小于3时，样品确定为空白基质。空白基质按照1.3节条件前处理，获得空白基质提取液。

1.2.4 基质标准工作溶液的配制

量取一定体积的混合标准溶液，用空白基质提取液稀释成适用浓度的基质标准工作溶液，现用现配。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品制备

实验所用鲤购自水产品批发市场，取其肝脏，将肝脏装入密实袋， -20 ℃冷冻保存，备用。

1.3.2 提取

准确称取1.0 g肝脏样品于10 mL玻璃匀浆器中，加入0.5 g无水硫酸钠与5 mL 0.1%甲酸乙腈，匀浆2 min，将匀浆液转入10 mL具塞离心管中，5 000 r/min离心5 min，待净化。

1.3.3 净化

分取1 mL上清液于2 mL玻璃离心管中，加入150 mg中性氧化铝、50 mg PSA及10 mg GCB,漩涡震荡1 min,以10 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm尼龙滤膜，供HPLC-MS/MS检测。

1.4 色谱质谱条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX Extend-C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温：35 ℃；流动相：A液为0.05%氨水，B液为乙腈；梯度洗脱条件：0～1 min，30% B；1～15 min，30%～60% B；15～17min，60%～30% B；进样量：5 μL；流速：0.4 mL/min。

1.4.2 质谱条件

电喷雾电离负离子源(ESI-)；扫描模式：多反应监测(MRM)模式；离子源温度为325 ℃；干燥气流量为10 L/min；雾化气压力：45 psi；鞘气温度为350 ℃；鞘气流量为12 L/min；毛细管电压为3 500 V。氟虫腈及其代谢物的详细质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

氟虫腈及其代谢物的化学结构中均含有-NH2基团，在负离子模式下易失去H而形成准分子离子。实验分别取1 mL质量浓度为1 mg/L的4种标准工作溶液利用流动注射泵进样，在负离子模式下对4种目标物进行母离子扫描,确定各组分的母离子，以化合物的离子峰为母离子，通过优化最佳碰撞能，进而确定化合物的定量离子和定性离子，同时对碎裂电压、毛细管电压等参数进行优化，确定最佳离子源测定条件(表1)。LC-MS/MS分析时发现离子驻留时间对目标峰的峰形及灵敏度影响较大。驻留时间过短，检测器的相对误差变大，可影响灵敏度；但驻留时间过长，会导致峰失真且重现性差，影响定性准确性。通过试验，本研究确定各监测离子的驻留时间为30 ms，此时，4种化合物的响应及峰形均最佳。

表1 氟虫腈及其代谢物质谱参数Tab.1 Mass spectrometric(MS) parameters for detection of fipronil and its metabolites

2.2 色谱条件的优化

氟虫腈及其代谢物为酸性化合物在质谱上以电喷雾负离子电离源(ESI-)检测，通常ESI-检测时流动相中加入氨水可促进化合物电离以增强质谱响应从而提高仪器灵敏度，实验选用安捷伦ZORBAX Extend-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱分离目标物，该色谱柱使用双配位键合相和双封端技术保证了高pH值时的稳定性，非常适合于碱性环境下分离酸性物质，分别比较了3组流动相在1.4.1节流动相梯度条件下的色谱行为：组1中A为水溶液，B为甲醇；组2中A为水溶液，B为乙腈；组3中A为 0.05% 氨水溶液，B为乙腈。结果表明，在乙腈-0.05% 氨水溶液体系下，通过梯度洗脱，氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈的峰形最佳、化合物响应值最高，水-甲醇体系下化合物色谱峰分离度及响应重现性均较差且系统压力大，故选择0.05%氨水溶液-乙腈为流动相。

2.3 提取方法及提取溶液的选择

实验将鲤肝脏放入装有提取液的玻璃匀浆器中研磨粉碎，研磨时肝脏组织被破碎、分散，保证了萃取液与提取溶剂的充分接触，该方法集均质、萃取于一体，不仅提高了溶剂的提取效率，还简化了实验步骤，具有省时、省力及高效的优点。

图1 不同提取溶剂对氟虫腈及其代谢物回收率的影响Fig.1 Effects of different extraction solvents on the recoveries of fipronil and its metabolites

根据相似相容原理，乙腈与氟虫腈及其代谢物含相同的-CN基团，易将目标化合物提取出来，乙腈可沉淀蛋白且对鱼肝脏中的脂溶性色素、脂肪等非极性成分的提取能力较弱，利于样品后续净化，因此，实验选择乙腈为提取溶液，考虑到氟虫腈及其代谢物是酸性物质，在提取剂乙腈中加入甲酸可抑制目标物解离，提高溶解度。实验考察了体积分数为0.1%、0.3%、0.6%及1.0%甲酸酸化乙腈的提取效率(图1)。结果表明，0.1%甲酸乙腈的萃取效率最佳，4种目标物的回收率均在80%～110%之间，随提取液中甲酸含量的增加，氟虫腈亚砜的回收率下降明显，回收率小于70%。分析原因：实验时观察到提取液的颜色随着甲酸含量的增加逐渐加深，表明其中所含杂质增多，而杂质可干扰目标物离子化、增大基质效应从而影响回收率，同时可能由于化合物性质不同，抗干扰的能力也不同，故氟虫腈亚砜回收率下降明显，而杂质的增多对其他目标物回收率影响不明显。此外，鱼肝脏中含大量水分，提取剂乙腈与水部分互溶可影响提取效率，故实验比较了无水Na2SO4与无水MgSO4的除水效果，发现无水MgSO4可吸附目标物，而无水NaSO4对目标物无吸附。因此，实验选用0.1%甲酸乙腈作为本方法的提取液，并在均质时加入0.5 g无水Na2SO4以除去肝脏组织中多余的水分。

2.4 净化条件的优化

鱼肝脏成分复杂，含大量水分、蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素与色素。本研究采用QuEChERS方法利用吸附剂中性氧化铝去除肝脏提取液中的脂肪和脂类等非极性有机物，PSA去除极性物质、脂肪酸、有机酸等杂质及少数色素，石墨化炭黑(GCB)去除色素和甾醇等，并考察了上述3种吸附剂不同质量水平及不同比例对回收率的影响：当PSA为200 mg、GCB为25 mg时，4种目标物的回收率在中性氧化铝加入量为150 mg时达最佳值，均在90%左右(图2A)，故选择中性氧化铝加入量为150 mg；当中性氧化铝为150 mg、GCB为25 mg及PSA为50 mg时，4种目标物回收率均在85%以上，且PSA对氟虫氰砜回收率的影响较大，其回收率随PSA含量的增加逐渐降低，但对其余3种目标物回收率的影响不明显，这可能与化合物性质不同有关，PSA含量的增加可吸附氟虫氰砜导致其回收率下降显著，但对其他3种目标物影响不大，故选择PSA加入量为50 mg(图2B)；吸附剂中GCB含量的增加对4种目标物回收率的影响均不明显，回收率在90%左右，表明10 mg GCB的加入量已能满足实验需求，最终确定组合条件为中性氧化铝150 mg+PSA 50 mg+GCB 10 mg用于样品前处理，净化后的肝脏提取液澄清透亮、基线平稳，目标化合物附近无干扰峰，表明该方法适合肝脏提取液的净化。

图2 不同吸附剂、不同用量及不同比例对回收率的影响A:弗罗里硅土；B:PSA；C: GCB。Fig.2 Effects of different sorbents, dosages and proportions on the recoveries of fipronil and its metabolitesA:Florida silica；B:PSA；C: GCB.

2.5 方法学考察

2.5.1 基质效应

采用液相色谱-质谱联用法分析时普遍存在基质效应，基质效应可导致目标化合物发生离子增强或抑制作用，从而影响定量分析的准确性和重现性。实验配制5 μg/L的基质标准溶液，与同等浓度的溶剂标准溶液进行对比测定，采用公式ME=空白基质标准响应值/纯溶剂标准响应值×100%，评价氟虫腈及其代谢物在鲤肝脏中的基质效应。当ME>1时，为基质增强效应；当ME<1时，为基质抑制效应；当ME=1时，无基质效应。一般情况下，ME在80%～120%内为正常的范围[23]。结果表明，氟虫腈及其代谢物在鲤肝脏中的基质效应在92.2%～116.0%之间(见表2)，说明基质对信号均呈增强作用，因此采用配制基质匹配标准曲线的方法降低基质效应提高定量分析的准确性。

2.5.2 线性范围与检出限

在优化的分析条件下，用空白鲤肝脏萃取基质分别配制质量浓度为0.4、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的氟虫腈及其代谢物混合标准溶液，经HPLC-MS/MS测定后，以农药定量离子峰面积(y)为纵坐标，农药基质标准溶液质量浓度为(x, ng/ml)横坐标，绘制标准曲线。利用肝脏的空白基质，通过氟虫腈及其代谢物标准物的添加，分别以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。氟虫腈及其代谢物在0.4～100.0 ng/mL线性范围内，线性良好，线性相关系数(r2)均大于0.997，检出限为2.0 μg/kg,定量限为5.0 μg/kg(表2)，远低于GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中所规定氟虫腈在禽类内脏中的最大残留限量20.0 μg/kg[24]。

2.5.3 回收率与精密度

以空白鲤肝脏为基质进行加标回收实验，添加浓度分别为10、20及40 μg/kg，每个添加浓度设6个平行，并做空白实验，采用基质匹配标准曲线进行定量分析，结果见(表3)。4种化合物的平均加标回收率在87.3%～109.2%之间，相对标准偏差在1.3%～12.0%之间，均小于15.0%，表明该方法具有较好的回收率和重现性，符合痕量分析的要求，添加回收色谱图(图3)。

表2 氟虫腈及其代谢物在肝脏基质中的回归方程、相关系数和检出限Tab.2 Regression equation, correlation coefficients(r2), limits of detection(LODs), limits of quantitation(LOQs) of fipronil and its metabolites in the liver matrix

表3 鲤肝脏中4种农药的回收率和精密度Tab.3 Average recovery and precision of 4 kinds of pesticides in the liver tissue of carp n=6

图3 加标鱼肝脏样品中氟甲腈(A)、氟虫腈(B)、氟虫腈砜(C)和氟虫腈亚砜(D)提取离子色谱图Fig.3 Extracted ion chromatogram of the standard addition of fipronil and its metabolites in the liver tissue of carp

3 样品测定

运用本研究建立的方法对市售的鲤、鲫(Carassiusauratus)各10份肝脏样品进行检测，所有样品均未检出氟虫腈及其代谢物残留。

4 结论

本研究建立了鱼肝脏中氟虫腈及其代谢物的QuEChERS/LC-MS/MS联用法，通过对实验条件的筛选和优化，确定了萃取试剂、净化方法等样品前处理条件及仪器分析参数，方法快速、准确、简便、环保且节约，适用于鱼肝脏中氟虫腈及其代谢物残留的检测，可为鱼肝脏中氟虫腈药物代谢及残留消除规律的研究提供技术支撑。