冰片治疗脑卒中的抗炎作用机制：基于网络药理探讨

胡 佳，高 宇，吴雨薇，喻坚柏

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410000；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410000)

冰片(Borneol)作为通开药[1]之凉开的代表药，其引药上行、启闭回苏、通关开窍的作用常用于治疗脑卒中。脑卒中后的炎症反应加重了血脑屏障的损坏、脑细胞的凋亡，是导致继发性脑损伤的关键因素[2-3]，其炎症反应可表现为病灶周边的中性粒细胞浸润、炎性介质的释放、细胞毒性水肿等[4]。《金匾要略》中有“血不利则为水”之说，即血行不畅易导致水液代谢障碍而引起水液停聚。若水液停聚于脑窍，浊水瘀血互结，闭阻清窍，进一步加重炎症反应。现代药理研究表明冰片具有快速开放血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)并促进其他药物通过[5]，减轻脑组织缺血缺氧及神经细胞毒性水肿，清除氧自由基，减轻神经细胞损害程度，即通过抗炎对大脑产生不同程度的保护作用，进而改善神经功能。邵新然等[6]通过测定缺血侧大鼠脑组织超氧化物歧化酶的活性，证实冰片对脑缺血-再灌注损伤模型大鼠的脑组织具有神经保护作用。虽然临床上冰片治疗脑卒中疗效明确，但是其具体作用机制尚不清楚。

中药网络药理学是通过生物学网络构建、网络可视化及网络分析，以“疾病-基因-靶点-药物”多层次、多视角的相互作用网络为理念，从整体上及分子网络层面上研究药物对疾病的影响。本研究通过筛选冰片的化合物成分，预测其在体内的靶蛋白及相互作用蛋白，分析靶蛋白及相互作用蛋白所涉及的信号通路，探讨冰片治疗脑卒中的抗炎机制，为进一步实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 冰片有效成分及其靶点预测

采用BATMAN-TCM数据库检索冰片所有有效成分及其对应的潜在靶点。通过统计分析，选择合适的统计方法设置显著性P值。BATMAN-TCM系统可以分析疾病靶点富集度的显著性水平并对有效成分与目标靶点相关性进行评分(score)。以P<0.05作为“药物-通路”网络构建的数据，以P<0.05，score cutoff=10为基准，显示冰片抗炎的显著性分析，及所对应的靶点和有效成分。

1.2 药物-成分-靶蛋白-疾病网络构建

根据上述预测结果，使用 Cytoscape软件中的关联功能(Merge)，将筛选出的活性成分、潜在靶点以及与靶点对应的疾病信息构建一个药物-靶点-成分-疾病网络。在生成的网络中，节点代表化合物、靶蛋白、药物或疾病，边代表化合物-靶点、药物-化合物以及靶点-疾病相互作用。应用Cytoscape中的Centiscape插件分析网络靶点的中心性(Centrality)，中介中心性(Betweenness centrality，BC)是一个节点担任其他两个节点最短路的桥梁次数。

1.3 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

KEGG数据库是一个联系基因组信息和功能信息的知识库，其子数据库PATHWAY汇集了分子交互作用及其反应网络人工通路图。基因本体GO(Gene Ontology)体系集成了多种异质数据库的信息，用结构化的自然语言术语对基因和基因产物的功能进行注释和分类，是研究基因功能相似性的有力工具。Bioconductor生物信息学软件集是建立在R语言环境上的面向生物信息管理和分析科学计算的开放式软件平台，包括有基因组数据分析和生物芯片数据等大量实用软件包。利用Bioconductor软件开放资源可以很好作为学习资料，并能分析各种样本数据。采用R/Bioconductor分析冰片和其抗炎的数据，然后进行标准化处理、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，进一步分析基因调控网络以及分子相互作用并进行可视化处理。

2 结果

2.1 冰片抗炎成分及其靶点

检索BATMAN-TCM发现冰片抗炎活性靶点共7个，与炎症通路有较大联系(见表1)。

表1 冰片的抗炎活性靶点

通过BATMAN-TCM检索上述靶点所对应的活性成分分别为右旋龙脑(d-borneol)、榄香脂素(elemicin)、β-律草烯(Beta-Humulene)、龙脑(Borneol)、樟脑(Camphor)、齐墩果酸(Oleanolic Acid)、麦珠子酸(Alphitolic Acid)、龙脑香内酯(Dryobalanone)、积雪草酸(asiatic acid，AA)、龙脑香醇酮(dipterocarpol)。

2.2 网络构建及分析

使用Cytoscape软件构建药物-成分-靶蛋白-疾病网络模型。从图1中可以看出冰片及10个主要活性成分的9个潜在靶点对比到炎症上，不同的活性成分可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，充分体现了冰片多成分、多靶点抗炎的作用机制。

图1 冰片活性成分-作用靶点网络

网络药理学方法可以收集中药活性成分并预测其相关靶点，与中药治疗疾病“多成分-多靶点”的模式契合，通过构建可视化网络，分析探索中药可能作用于疾病的关键靶基因及信号通路，为中药研究提供新的思路与方法。

本研究基于网络药理学方法，共收集冰片抗炎靶点7个，有效成分10种，构建药物-成分-靶蛋白-疾病网络图，根据BC分析(表2)可知药物成分前两位为Elemicin(BC=20.7166667)、Beta-Humulene(BC=16.0833333)；说明冰片多通过上述两种药物影响炎症基因。靶点前三位为PPARD(BC=7.55)、ADK(BC=3.5297619)、DHFR(BC=3.5297619)，说明冰片主要通过上述靶点发挥抗炎作用。

表2 节点中心度分析

2.3 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

采用R/Bioconductor分析冰片和其抗炎的数据，以pvalueCutoff =0.05，qvalueCutoff = 0.05进行GO功能富集分析，绘制柱状图(图2)及气泡图(图3)。

图2 冰片和其抗炎的GO功能富集分析(柱状图)

图3 冰片和其抗炎的GO功能富集分析(气泡图)

为了进一步分析冰片抗炎的基因和通路，对以上7个靶点进行GO功能(表4)和KEGG通路富集分析，显示冰片可能通过羧酸结合(carboxylic acid binding)、有机酸结合(organic acid binding)、单碳水化合物酸结合(monocarboxylic acid binding)、长链脂肪酸结合(long-chain fatty acid binding)、脂肪酸结合(fatty acid binding)、花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)的信号通路发挥抗炎作用。

表3 GO功能富集前十位

采用R/Bioconductor分析冰片和其抗炎的数据，以pvalueCutoff =0.05，qvalueCutoff = 0.05进行KEGG通路富集分析，仅有PLA2G1B/PTGS2作用于花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)。绘制通路图(图4)。

图4 炎性信号KEGG通路

3 讨论

脑卒中为“风、痨、臌、膈”四大顽症之首，其高发病率、高致残率、高致死率的特点使之严重危害着人类健康。冰片作为开窍药可通利清窍络脉，使气血津液升降出入恢复正常，停聚脑窍之浊液得以运化，消除炎症反应，降低脑组织代谢，促进神经功能恢复，保护脑组织。

本研究通过文献挖掘筛选出冰片的10种抗炎活性成分，目前研究已确切证实的抗炎成分有齐墩果酸(OA)，右旋龙脑(NB)，积雪草酸。如OA可能通过抑制JAK/STAT通路下调HMGB1，发挥蛛网膜下腔出血后早期脑组织保护作用[11]；NB可以抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌等细菌的生长[12]；积雪草酸通过下调LPS诱导的HepG2细胞炎性相关因子TNF-α、IL-β以及IL-6的分泌，发挥抗炎、抗氧化作用[13]。其余活性成分的抗炎作用还有待于通过实验进一步明确。

靶点预测结果显示，PPARD、ADK、DHFR是冰片抗炎的关键靶点。PPARD是过氧化物酶体增殖物激活受体PPARs的亚型，不仅广泛参与机体的糖代谢、脂质代谢、能量代谢过程，在炎症过程中也发挥重要作用[14]。ADK是调节中枢及外周神经系统中细胞内外腺苷水平的关键酶，ADK在脑损伤急性期介导神经保护作用，在慢性期介导神经毒性作用[15]。DHFR是一种利用还原型辅酶Ⅱ还原二氢叶酸产生四氢叶酸的氧化还原酶。DHFR作为改变细胞增生的靶点，该基因在白血病耐药细胞株等肿瘤耐药细胞株中高度表达，并且在肿瘤多药耐药中发挥着一定的作用[16]。

KEGG代谢通路及GO功能富集结果显示，冰片靶点参与多条抗炎镇痛通路，其中以花生四烯酸(AA)代谢通路为主。武璞[17]研究表明缺血性脑卒中及再灌注损伤与花生四烯酸代谢通路有密切关系，LTS的高表达参与急性期缺血性神经细胞水肿的形成，促进血小板聚集、抑制PGI2合成，刺激TXA2合成，降低脑血管的张力，是脑梗死时的致病性介质。汪天青[18]研究表明射干的有效活性成分可通过抑制花生四烯酸COX-2代谢途径，减少致炎性代谢产物的生成。醒脑静通过影响花生四烯酸代谢，降低TNF、IL-1、IL-6水平并改变脑组织超微结构，且抑制TXB2合成、促进6-Keto-PGF生成[19]。

冰片中的一些成分可通过阻断前列腺素的分泌、调动氨基酸代谢、调节脂肪代谢中的游离脂肪酸含量的途径，并通过三羧酸循环和半乳糖代谢维持机体能量需求来发挥抗炎作用，仍需进一步通过实验进行确定。本研究中通过网络药理学研究冰片的化学成分与相关靶点，初步预测其分子基础和作用机理，进一步研究可利用中药化学提取技术找到与冰片抗炎的主要成分，揭示其成分含量、药效物质基础。