芹菜素对人肝癌HepG2细胞糖酵解的影响及体内实验研究

张 睿，陈瑞妮，李 伟

(1.江苏省中医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学 医学院·整合医学学院，江苏 南京 210023；3.南京中医药大学 中医学院·中西医结合学院，江苏 南京 210023)

芹菜素(4′，5，7-三羟基黄酮；apigenin，API)又称芹黄素、洋芹素，是天然存在的黄酮类化合物，广泛存在于水果、蔬菜(如芹菜)、茶叶和香料中[1]。许多中药中含有大量芹菜素，如藜芦、紫苏、虎杖、芜花、半枝莲、仙鹤草等[2]。大量实验研究表明，芹菜素具有抗炎、抗癌、抗氧化、调节内分泌等多方面的生物活性[3]。芹菜素对多种人类肿瘤细胞具有细胞毒性作用，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌等[4]。研究证实，芹菜素通过诱导凋亡及诱导周期阻滞于G2/M期而抑制肝癌细胞的生长[5]。即便是在有氧环境中，肿瘤细胞仍然偏好通过糖酵解途径提供能量并生成乳酸，但芹菜素对人肝癌细胞糖酵解的作用研究较少。

本研究选用人肝癌HepG2细胞[6]，体外研究芹菜素对肝癌细胞增殖、糖酵解及相关蛋白的作用，探讨其作用机制，再利用裸小鼠移植瘤模型考察芹菜素的体内作用。本研究针对芹菜素对人肝癌细胞糖酵解的影响及可能的机制进行探究，从而验证芹菜素抗肿瘤活性，也为中医临床肿瘤防治时芹菜素的应用提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验药物

芹菜素(Apigenin)，纯度≥97%，购自美国Sigma公司。实验前，芹菜素用DMSO溶解，培养基稀释至所需浓度，DMSO终浓度≤0.1%。

1.2 动物与细胞

SPF级BALB/c小鼠，购自常州卡文斯实验动物有限公司(实验动物生产许可证：SCXK(苏)2011-0003)。日龄：35～40 d；体重：18～22 g；性别：雄性。

人肝癌HepG2细胞，购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学细胞库。细胞贴壁生长，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

1.3 试剂

溴脱氧尿核苷(BrdU)购自美国Sigma公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；葡萄糖摄取检测试剂盒购自Invitrogen公司；乳酸生成检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；PDHK1、HKⅡ、LDHA、HIF-1α购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体购自武汉Boster公司；IRDyeTM800 Conjugated anti-mouse/rabbit second antibody购于美国 Rockland公司；苏木素购自碧云天公司；免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒：购自南京凯基生物公司。

1.4 仪器

HERA cell 150i CO2培养箱、MSC-Advantage 1.2生物安全柜(美国Thermo electron公司)；DFC450 C型倒置显微镜(德国Leica公司)；Centrifuge 5415R型冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；MATRIX Cell Mate II型精密移液器(美国Thermo公司)；FV10-MCPSU型激光共聚焦显微镜(日本Olympus)；Mini-PROTEAN 3型电泳装置(美国Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 细胞培养 人肝癌细胞HepG2以适量浓度接种于培养瓶中，加入含10% 胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃恒温及饱和湿度的培养箱中培养，培养条件为：37 ℃，20%O2，5% CO2和75% N2。细胞呈贴壁生长。每2～3 d传代一次，传代时用0.02% EDTA，0.25% 胰酶消化2～3 min，弃去消化液，加入新培养液吹打均匀，按所需细胞量移入新培养瓶，添加完全培养液至适量。

1.5.2 检测掺入BrdU的细胞比例 将HepG2细胞种入使用100 μg· L-1多聚赖氨酸包被过的盖玻片于6孔板中进行细胞爬片，待到细胞长到70%～80% 时分别给予不同浓度的芹菜素或等体积的DMSO，使终浓度为2，4，8 μmol·L-1。培养24 h后将BrdU加入细胞培养基中，终质量浓度是30 mg·L-1，继续培养30 min后，进行抗BrdU免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下随机拍摄上下左右中共5个视野。结果以BrdU+细胞百分比衡量。BrdU阳性细胞比= BrdU阳性细胞数/总细胞数×100%，对照组定义为100%，取这5个视野中的平均值统计分析。

1.5.3 Annexin V-FITC/PI双染 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35～36 kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此，Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。人肝癌HepG2细胞接种于6孔板中，密度为1×105个/mL。芹菜素处理后，分别置于常氧/缺氧条件下培养24 h。收集细胞，洗涤。将上述细胞悬液离心弃上清，依Annexin-V/PI双染试剂盒操作：将细胞数调整到(2～5)×105个/mL，用结合缓冲液500 μL 中重新悬浮细胞，加入5 μL Annexin-V染液，混匀并离心，再加入5 μL PI染液，混匀并离心，避光孵育15 min，于流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.5.4 分析细胞糖酵解水平及相关蛋白表达 HepG2细胞经终浓度为20、40、80 μmol/L的芹菜素或等体积DMSO处理24 h，收集细胞后，用葡萄糖摄取检测试剂盒和乳酸生成检测试剂盒分析HepG2细胞中糖酵解水平。HepG2细胞经终浓度为20、40、80 μmol/L的芹菜素或等体积DMSO处理24 h，收集细胞并提取蛋白，进行免疫印迹分析。

1.5.5 EMSA检测细胞中HIF-1α与DNA结合能力 电泳迁移实验(EMSA)反应液由以下成分组成：①8 μg的按实验所需条件处理的HepG2细胞的核蛋白；②20 μL的结合缓冲液；③1 μL的生物素标记的寡核苷酸探针(0.2 μmol/L)：HIF-1α(5′-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3′，3′-AGA CAT GCA CTG GTG TGA GTG GAG-5′)，脱氧核糖核苷酸生物素标记末端的共识寡核苷酸探针；④野生型的未标记的 HIF-1α探针(10 μmol/L)；⑤突变型的未标记的HIF-1α探针(1.75 μmol/L)：HIF-1α(5′-TCT GTA AAA GAC CAC ACT CAC CTC-3′，3′-AGA CAT TTT CTG GTG TGA GTG GAG-5′)；⑥Stat3 抗体。电泳迁移混合液室温放置20 min，加入5 μL的上样缓冲液，DNA-蛋白复合物，在0.5×Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液中，经6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳380 mA，1 h后，转移到带正电荷的硝酸纤维素膜，并经紫外交联。最后，使用化学发光电泳迁移工具包，通过Bio-Rad红外系统使凝胶转移可视化。

1.5.6 裸鼠移植瘤实验 取对数生长期的HepG2细胞，以0.1 mL(2×106个)接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至50～100 mm3后将动物随机分组，每组6只。设4个组别，分别为生理盐水对照组、芹菜素100 mg/kg组、芹菜素200 mg/kg组、芹菜素400 mg/kg组。芹菜素腹腔注射隔天给药，30 d后，裸鼠处死，手术剥取瘤块并比较分析各组瘤体积和瘤重。抑瘤率(tumor inhibitory ratio)的计算公式为：

抑瘤率% =(1-给药组平均瘤重/空白组平均瘤重)×100%

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 芹菜素对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

对各组中BrdU阳性的HepG2细胞和DAPI阳性的总细胞计数。如图1所示，与对照组比较，芹菜素给药组BrdU阳性的数目比例显著减少，40 μmol/L处理组与对照组相比其差异具有统计学意义(P<0.05)，80 μmol/L处理组与对照组相比差异具有显著性(P<0.01)，表明芹菜素在体外可以剂量依赖性地抑制HepG2细胞的增殖。Annexin V-FITC/PI双染结果显示，80 μmol/L芹菜素处理组HepG2细胞凋亡率为41.3%，20 μmol/L和40 μmol/L芹菜素对HepG2细胞的凋亡诱导作用较弱。

2.2 芹菜素对HepG2细胞糖酵解作用的影响

肿瘤细胞的代谢有一个显著的特点，即高水平的糖酵解作用。检测各组HepG2细胞内葡萄糖摄取和乳酸生成水平。结果如图2所示，与对照组比较，芹菜素给药组内HepG2细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成水平均有所下降，40 μmol/L处理组与对照组相比其差异具有统计学意义(P<0.05)，80 μmol/L处理组与对照组相比差异具有显著性(P<0.01)，表明芹菜素在体外可以剂量依赖性地抑制HepG2细胞的糖酵解作用。

2.3 芹菜素对HepG2细胞内HIF-1α及糖酵解相关蛋白表达的影响

HIF-1α上调多种糖酵解的因素，包括HKII和LDHA。同时，HIF-1α通过抑制丙酮酸脱氢酶来抑制丙酮酸进入线粒体，从而导致三羧酸循环受到抑制，这一过程需要PDHK1的诱导。Western blot检测结果表明，芹菜素可以降低HepG2细胞内糖酵解相关蛋白(PDHK1、HKII和LDHA)的表达，同时下调HIF-1α的表达(见图3)，其中，80 μmol/L作用效果非常明显(P<0.01)，提示芹菜素可抑制HepG2细胞内糖酵解。

图3 芹菜素对HepG2细胞糖酵解相关蛋白的影响

2.4 芹菜素对HIF-1α与DNA结合能力的影响

EMSA的结果(见图4)显示，芹菜素对HIF-1α与DNA的结合能力也有明显的抑制作用。从40 μmol/L开始表现出很好的效应，加药组与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)，以上结果表明芹菜素通过调节HIF-1α的表达及其与DNA结合能力发挥抗肿瘤作用。

2.5 芹菜素对HepG2细胞裸鼠移植瘤的影响

裸鼠移植瘤实验结果表明(见图5、图6)，芹菜素在体内有着较好的抑瘤作用，芹菜素100 mg/kg组瘤体积的相对增殖率为86.09%，抑瘤率为22.33%；芹菜素200 mg/kg组瘤体积的相对增殖率为75.97%，抑瘤率为37.32%；芹菜素400 mg/kg组瘤体积的相对增殖率为61.77%，抑瘤率高达53.67%。

注：*P<0.05，**P<0.01。

图5 芹菜素对HepG2细胞裸鼠移植瘤体积的影响(n=6)

图6 芹菜素对HepG2细胞裸鼠移植瘤瘤重的影响(n=6)

2.6 芹菜素对瘤组织内HIF-1α及糖酵解相关蛋白表达的影响

对移植瘤组织的石蜡切片进行免疫组化分析，结果(见图7)与体外Western blot结果一致，400 mg/kg芹菜素可以明显降低瘤组织内糖酵解相关蛋白(PDHK1、HKII和LDHA)的表达，同时下调HIF-1α的表达，提示芹菜素在体内也有抑制肿瘤细胞糖酵解的作用。

图7 芹菜素对HepG2细胞移植瘤组织糖酵解相关蛋白的影响

3 讨论

本研究定位于中药有效成分芹菜素，体内利用裸鼠移植瘤模型验证芹菜素体内抑制肿瘤糖酵解的效应，并且可以实时、动态地观察药物对肿瘤生长的抑制作用。结合经典的体外细胞实验发现芹菜素在体内外都具有一定的抑制肿瘤细胞糖酵解的作用。进一步研究发现，芹菜素可以通过抑制HIF-1α与DNA的结合能力从而抑制糖酵解发挥其抗肿瘤的作用。

肿瘤细胞能量代谢异常的表现众多，除糖代谢异常外，肿瘤组织还存在脂肪酸代谢、氨基酸代谢异常[7-8]。糖酵解过度活跃，线粒体有氧代谢削弱，是肿瘤细胞发生糖代谢异常的重要原因[9-10]。HIF-1α作为具有转录活性的核蛋白，具有相当广泛的靶基因谱，在增强肿瘤细胞的糖酵解和促进肿瘤新生血管生成中都十分重要[11-12]。此外，实体瘤缺氧区的存在以及肿瘤细胞糖酵解增强还会导致肿瘤患者对治疗产生抵抗，对化疗药物失去敏感产生耐受，最终导致肿瘤的复发与转移[13-14]。芹菜素有抑制肿瘤细胞糖酵解作用提示：芹菜素可能改善化疗药物耐受，或与化疗药物联合应用可达到增效减毒的效果，值得进一步探索。本研究为芹菜素用于防治肿瘤展示了有力证据，并提供了新的研究方法和研究模式。