黄绵马酸BB对革兰阳性致病菌的抗菌活性和生物被膜清除作用研究

莫梓童，吴小诗，殷川平，唐春萍，沈志滨, 2, 3*

黄绵马酸BB对革兰阳性致病菌的抗菌活性和生物被膜清除作用研究

莫梓童1，吴小诗1，殷川平1，唐春萍1，沈志滨1, 2, 3*

1. 广东药科大学中药学院，广东 广州 510006 2. 广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心，广东 广州 510006 3. 广东省化妆品工程技术研究中心，广东 广州 510006

探究黄绵马酸BB对3种革兰阳性致病菌的抗菌活性及生物被膜的清除作用。采用微量稀释法测定黄绵马酸BB对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant，MRSA）、粪肠球菌（，EFA）及屎肠球菌（，EFM）15株临床分离株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）；考察黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生长周期的影响；采用CCK-8法、扫描电子显微镜（SEM）考察黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的清除作用。黄绵马酸BB对MRSA的MIC为11.49～63.50 µg/mL、MBC为22.98～160.00 µg/mL，对EFA的MIC为7.07～160.00 µg/mL、MBC为28.28～160.00 µg/mL，对EFM的MIC为16.82 µg/mL、MBC为56.57 µg/mL，其中黄绵马酸BB对MRSA1、2和EFA14、15的MIC均小于莫匹罗星；黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15的生长具有抑制作用，能延迟受试菌进入对数生长期；MIC黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的清除率分别达到85.15%、76.48%、82.31%，均优于莫匹罗星、万古霉素、达托霉素；黄绵马酸BB对MRSA2生物被膜聚集及成熟阶段的清除效果优于达托霉素，对EFA13生物被膜聚集及成熟阶段的清除效果优于莫匹罗星、万古霉素、达托霉素，对EFM15生物被膜成熟阶段的清除效果优于莫匹罗星、万古霉素、达托霉素。黄绵马酸BB具有良好的体外抑菌活性以及对生物被膜的清除作用。

革兰阳性球菌；黄绵马酸BB；抗菌药物；抗菌活性；生物被膜

革兰阳性球菌是临床常见的致病菌，可引起多种感染，甚至形成败血症、多器官化脓性感染，危害人类的生命健康[1]。金黄色葡萄球菌、粪肠球菌，EFA）和屎肠球菌（，EFM）为革兰阳性球菌中具代表性的致病菌，其对抗生素的耐药性不断增强[2]。革兰阳性球菌形成的生物被膜是对抗生素耐药性增强的最主要原因之一。生物被膜是由细菌自身产生、胞外聚合物包裹并黏附于机体表面的多细胞群体结构，不仅具有多重耐药性及免疫逃逸能力，还表现出高致病性、难治愈的特性[3]。近年来研究显示，革兰阳性球菌对常见的抗菌药物如莫匹罗星产生了不同程度的耐药性[4]，而被称为“抗菌最后一道防线”的万古霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantMRSA）的敏感性逐步下降[5]，万古霉素中介耐药的MRSA检出率逐年攀升[6]。因此，从传统中药中寻找具有抗菌活性的化合物具有重要意义。

香鳞毛蕨(L.) Schott是鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物，主要分布在黑龙江省五大连池等地区[7]，民间常用香鳞毛蕨治疗牛皮癣、头癣等多种皮肤病。香鳞毛蕨中的间苯三酚类化合物因其独特的抗菌活性受到人们的关注[8]，黄绵马酸BB作为其中典型的间苯三酚类化合物，对MRSA表现出良好的抗菌活性[9]，但黄绵马酸BB对革兰阳性球菌生物被膜形成的作用暂无报道。本研究通过探究黄绵马酸BB对革兰阳性常见致病菌MRSA、EFA和EFM的抗菌活性和生物被膜的清除作用，为黄绵马酸BB的抗感染新药开发提供参考。

1 材料

1.1 菌株

10株MRSA临床分离株（MRSA1～10）、4株粪肠球菌临床分离株（EFA1～14）、1株屎肠球菌临床分离株（EFM15）由广东莱恩医药研究院有限公司惠赠。

1.2 药品与试剂

黄绵马酸BB（质量分数＞95%）由课题组自制；万古霉素（质量分数＞97%，批号N0827A）购自美国Sigma公司；达托霉素（质量分数＞97%，批号M0726A）购自大连美仑生物技术有限公司；莫匹罗星（质量分数＞97%，批号80200123218）购自中美天津史克制药有限公司；CAMHB营养肉汤培养基（批号2017090）、营养琼脂培养基（批号3105705）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB，批号1090952）购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 仪器

SW-CJ-1F超净工作台（苏净集团安泰公司）；iMark酶标仪（美国BIO-RAD公司）；Memmert恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；XYQ-SG46-280S电热手提式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；JEM-2100HR冷场发射扫描电子显微镜（SEM，日本电子株式会社）。

2 方法

2.1 菌液制备

将上述菌株用营养琼脂培养基培养至对数生长期，根据美国临床实验室标准协会（clinical and laboratory standards institute，CLSI）制定的M07-A9方案中微量稀释法，将处于对数生长期的菌落用CAMHB营养肉汤培养基稀释成1×106CFU/mL的接种菌液[10]。

2.2 药液制备

黄绵马酸BB、莫匹罗星、万古霉素、达托霉素分别溶于二甲基亚砜，配制成质量浓度为64 mg/mL的药物储备液。

2.3 黄绵马酸BB对受试菌株的抗菌活性测定

采用微量稀释法测定黄绵马酸BB和阳性对照药物（莫匹罗星、万古霉素、达托霉素）对受试菌株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。用CAMHB营养肉汤培养基将药物储备液进行稀释，取100 μL药物储备液加入96孔板中，再加入100 μL菌液，使黄绵马酸BB、莫匹罗星、万古霉素、达托霉素的终质量浓度均为5.00～2 560.00 μg/mL，对照组只加入菌液不加入药液。于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h后，测定MIC。选择质量浓度≥MIC的菌悬液，吸取20 µL涂于固体培养基上，于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h后肉眼观察，以无细菌生长的最低药物浓度作为MBC。

2.4 黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生长曲线的测定

根据抗菌活性结果，选用对黄绵马酸BB敏感的MRSA2、EFA13和EFM15作为受试菌，测定黄绵马酸BB对其生长的影响。设置对照组及黄绵马酸BB（1/2 MIC、MIC、2 MIC）组，各给药组加入含相应药物的菌液，对照组只加入菌液不加入药液，于37 ℃振荡培养，每2小时采用酶标仪测定24 h内600 nm处的吸光度（）值。以时间为横坐标，值为纵坐标，绘制时间-曲线。

2.5 黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的清除作用

2.5.1 MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜生长曲线的测定 用TSB培养基将菌悬液稀释至1×106CFU/mL，取200 μL接种于96孔板中，于37 ℃分别培养0、3、6、9、12、24、36、48 h，弃去悬浮菌液，PBS漂洗3次，弃去上清液，每孔加入100 μL TSB培养基和10 μL CCK-8试剂，37 ℃避光孵育2 h，采用酶标仪测定450 nm处值，绘制值-时间曲线。

2.5.2 黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生长阶段清除率的影响 用TSB培养基将菌悬液稀释至1×106CFU/mL，取200 μL接种于96孔板中，MRSA2于37 ℃分别培养3、9、36 h，EFA13和EFM15于37 ℃分别培养3、6、24 h，PBS漂洗3次，弃去上清液；分别加入200 μL含不同质量浓度黄绵马酸BB及各阳性对照药的TSB培养基，使各药物的终质量浓度为5.00～2 560.00 μg/mL，对照组只加入菌液不加入药液，阴性对照组只加入培养基，继续培养24 h。PBS漂洗3次，弃上清液，每孔加入100 μL TSB培养基和10 μL CCK-8试剂，37 ℃避光孵育2 h，采用酶标仪测定450 nm处的值，计算药物对受试菌生物被膜的清除率。

清除率＝(阴性对照-药物)/(阴性对照–对照)

2.5.3 SEM观察黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生长阶段的清除效果 将14 mm无菌圆形爬片放入24孔板中，用TSB培养基将菌悬液稀释至1×106CFU/mL，取1 mL接种于24孔板中，MRSA2于37 ℃分别培养3、9、36 h，EFA13和EFM15于37 ℃分别培养3、6、24 h，弃去悬浮液，PBS漂洗3次，弃去上清液。设置对照组及黄绵马酸BB（1/2 MIC、MIC、2 MIC）组，各给药组加入含相应药物的TSB培养基，对照组只加TSB培养基，于37 ℃培养24 h，无菌PBS冲洗3次，弃上清液，制备SEM标本，SEM下观察并拍照[11]。

2.6 数据统计与分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，所有实验重复3次，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。

3 结果

3.1 黄绵马酸BB对受试菌株的抗菌活性

如表1所示，黄绵马酸BB对15株受试菌的MIC为7.07～160.00 µg/mL，MBC为22.98～160.00 µg/mL；万古霉素对15株受试菌的MIC为0.50～1.00 µg/mL，MBC为0.50～4.00 µg/mL；达托霉素对15株受试菌的MIC为0.50～8.00 µg/mL，MBC为1.00～16.00 µg/mL；莫匹罗星对15株受试菌的MIC为0.25～2 560.00 µg/mL，MBC为1.00～5 120.00 µg/mL。黄绵马酸BB抑菌活性由高到低排序依次为EFA13＞MRSA2＞EFM15＞其他受试菌株。黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13、EFM15抗菌活性较好，因此选取MRSA2、EFA13和EFM15作为黄绵马酸BB时间-杀菌曲线和生物被膜清除率实验的受试菌株。

3.2 黄绵马酸BB对受试菌株生长曲线的影响

如图1所示，对照组MRSA2接种4 h后进入对数生长期，1/2 MIC、MIC黄绵马酸BB将对数生长期延迟至6 h，2 MIC黄绵马酸BB将对数生长期延迟至8 h；对照组EFA13接种4 h后进入对数生长期，黄绵马酸BB组菌株6 h后进入对数生长期；对照组EFM15接种6 h后进入对数生长期，MIC、2 MIC黄绵马酸BB将对数生长期分别延迟至8、12 h。表明黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15的生长具有良好的抑制作用，呈剂量相关性。

3.3 MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的生长曲线

受试菌生物被膜的形成分为初黏附阶段、聚集阶段和生物膜成熟阶段。如图2所示，MRSA2、EFA13和EFM15均在培养3 h后达到初黏附阶段；EFA13和EFM15在3～6 h为聚集阶段，6～24 h形成成熟的生物被膜；MRSA2在3～9 h为聚集阶段，9～36 h形成成熟生物被膜。

表1 黄绵马酸BB对受试菌株的MIC和MBC

图1 黄绵马酸BB对MRSA2 (A)、EFA13 (B) 和EFM15 (C) 的时间-杀菌曲线

图2 MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的生长曲线

3.4 黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生长阶段清除率的影响

如图3-A～C所示，初黏附阶段，黄绵马酸BB对MRSA2生物被膜的清除率呈剂量相关性，万古霉素对MRSA2生物被膜的清除率优于黄绵马酸BB；聚集阶段，黄绵马酸BB对MRSA2生物被膜的清除率均优于各阳性对照药物；成熟阶段，黄绵马酸BB对MRSA2生物被膜的清除率仍保持在较高的水平，其清除率优于达托霉素。

如图3-D～F所示，初黏附阶段和聚集阶段，黄绵马酸BB对EFA13生物被膜的清除率处于较高水平，其清除率与万古霉素、达托霉素相当，优于莫匹罗星；成熟阶段，黄绵马酸BB对EFA13生物被膜的清除率均优于各阳性对照药物。

如图3-G～I所示，初黏附阶段，黄绵马酸BB对EFM15生物被膜仍有明显的清除作用，其清除率与万古霉素、达托霉素相当，优于莫匹罗星；聚集阶段，黄绵马酸BB对EFM15生物被膜的清除率均优于各阳性对照药物；成熟阶段，黄绵马酸BB对EFM15生物被膜的清除作用仍较为明显，其效果优于各阳性对照药物。

综上，黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生长阶段均表现出较好的清除作用，其中EFA13对黄绵马酸BB的清除作用最为敏感，MIC黄绵马酸BB对生物被膜的清除作用均优于莫匹罗星、万古霉素、达托霉素。

A、D、G-初黏附阶段（培养3 h） B、E、H-聚集阶段（培养6 h） C、F、I-成熟阶段（培养24 h）

3.5 黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生长阶段的清除效果

如图4～6所示，对照组MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜细胞形态正常，菌体细胞间结合紧密，胞外基质黏附于受试菌表面，结聚成团，呈片状生物被膜，且随培养时间的增加，生物被膜厚度增加。在生物膜形成的相同阶段，1/2 MIC黄绵马酸BB组各受试菌形态基本正常，分泌的胞外基质较对照组少，部分生物被膜结构稀疏；MIC黄绵马酸BB组各受试菌形态基本正常，生物被膜结构较1/2 MIC黄绵马酸BB组更为稀疏，且生物被膜表面细菌排列混乱；2 MIC黄绵马酸BB组各受试菌菌体变形、皱缩，生物被膜结构瓦解，甚至无菌团，仅有零星的单个菌体。

4 讨论

随着广谱抗生素的滥用，革兰阳性球菌的耐药性逐年升高。因此，寻找具有抗菌活性的化合物，取代或部分取代抗生素成为研究的热点。香鳞毛蕨中间苯三酚类对多种真菌均具有较好的抑制作用，黄绵马酸BB作为其中间苯三酚类的有效抗菌成分之一，目前有关其抗革兰阳性球菌的报道较少。根据CLSI中M100-S22方案，当药物对微生物的MBC/MIC≥32时，可判定该微生物对该受试药产生了耐受性[12]。本研究结果显示，MRSA1、2、6和EFA11～14对莫匹罗星均产生耐药性，MRSA2、5、6、10以及EFA13、14对达托霉素的敏感性下降，黄绵马酸BB对莫匹罗星耐药以及达托霉素敏感性下降的MRSA、EFA临床分离株均有良好的敏感性，具有开发成抗革兰阳性球菌感染新药的潜力。

图4 黄绵马酸BB对MRSA2各阶段生物被膜的清除作用

图5 黄绵马酸BB对EFA13各阶段生物被膜的清除作用

图6 黄绵马酸BB对EFM15各阶段生物被膜的清除作用

临床研究发现，MRSA、EFA和EFM均有较强的生物被膜形成能力，抗菌药物难以达到有效杀菌浓度，从而对抗生素产生耐药性[13]。本研究通过CCK-8法首次探究了黄绵马酸BB对生物被膜的清除作用，发现黄绵马酸BB对受试菌株形成的生物被膜均表现出较好的清除作用，尤其在生物被膜的聚集阶段及成熟阶段，其作用效果均优于莫匹罗星和达托霉素。通过SEM观察各受试菌株的生物被膜，发现1/2 MIC黄绵马酸BB可以抑制生物被膜的形成，减少胞外基质的生成，提示黄绵马酸BB可干扰生物被膜的形成，有希望开发为治疗生物被膜感染的药物。MIC黄绵马酸BB对MRSA2、EFA13和EFM15成熟的生物被膜的清除率分别为85.15%、76.48%、82.31%，其效果均优于各阳性对照药物。

综上，本研究以革兰阳性球菌中常见致病菌为研究对象，阐述了黄绵马酸BB的抗菌活性以及对生物被膜的清除作用，为间苯三酚类化合物抗菌作用提供了理论依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 李春香, 李忠原, 李显彬, 等. 2015—2017年某三甲医院住院患者血培养病原菌分布及耐药性 [J]. 中国感染控制杂志, 2018, 17(10): 860-865.

[2] 郑远明, 毕晓英, 周杰. 某三甲医院主要革兰阳性菌临床分布及耐药性分析 [J]. 国外医药: 抗生素分册, 2020, 41(1): 42-47.

[3] 王洪彬, 朱利霞, 于秀剑, 等. 细菌生物被膜研究进展 [J]. 动物医学进展, 2019, 40(9): 74-79.

[4] 陈雯静, 何春燕, 杨涵, 等. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对莫匹罗星、夫西地酸和瑞他莫林的耐药性分析 [J]. 检验医学, 2019, 34(1): 33-37.

[5] Hu H C, Kao K C, Chiu L C,. Clinical outcomes and molecular typing of heterogenous vancomycin- intermediatebacteremia in patients in intensive care units [J]., 2015, 15: 444.

[6] Hankinson S J, Sultanik E A, Ramani G V. Aortic root abscess with aorta to right atrium fistula due to vancomycin-intermediate(VISA) [J]., 2019, 2019: 3627063.

[7] 陈玲玲, 梁彦涛, 卜志刚, 等. 黑龙江省香鳞毛蕨六个天然分布地种群结构分析 [J]. 北方园艺, 2016(24): 70-76.

[8] 康廷国. 中药鉴定学[M]. 北京: 中国中医药出版社, 2007: 115.

[9] 殷川平, 陈文浩, 莫梓童, 等. 黄绵马酸BB对皮肤软组织感染致病菌的抗菌活性及机制研究[J]. 中草药, 2021, 52(6): 1662-1667.

[10] Ko S J, Kang N H, Kim M K,. Antibacterial and anti-biofilm activity, and mechanism of action of pleurocidin against drug resistant[J]., 2019, 127: 70-78.

[11] Sharifi A, Mohammadzadeh A, Zahraei Salehi T,. Antibacterial, antibiofilm and antiquorum sensing effects ofandessential oils againstisolates [J]., 2018, 124(2): 379-388.

[12] 周本宏, 李妍, 周梦宇, 等. 消炎抗菌片的抗菌活性及对福氏志贺氏菌的抗菌机制初步探讨 [J]. 中国医院药学杂志, 2018, 38(23): 2429-2433.

[13] Dufour D, Leung V, Lévesque C M. Bacterial biofilm: Structure, function, and antimicrobial resistance [J]., 2010, 22(1): 2-16.

Antibacterial activity and antibiofilm effect of flavaspidic acid BB against gram-positive pathogenic bacteria

MO Zi-tong1, WU Xiao-shi1, YIN Chuan-ping1, TANG Chun-ping1, SHEN Zhi-bin1, 2, 3

1. School of Traditional Chinese Medicines, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. Guangdong Provincial Engineering Center of Topical Precise Drug Delivery System Preperations, Guangzhou 510006, China 3. Guangdong Provincial Cosmetics Engineering Technology Research Center, Guangzhou 510006, China

To explore the antibacterial activity of flavaspidic acid BB on three kinds of gram-positive pathogenic bacteria and the scavenging effect of biofilm.Microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of flavaspidic acid BB on 15 clinical isolates of methicillin-resistant(MRSA),(EFA) and(EFM); Effect of flavaspidic acid BB on growth cycle of MRSA2, EFA13 and EFM15 was investigated; CCK-8 method and scanning electron microscopy (SEM) were used to investigate the scavenging effect of flavaspidic acid BB on MRSA2, EFA13 and EFM15 biofilms.MIC and MBC of flavaspidic acid BB for MRSA were 11.49 — 63.50 µg/mL and 22.98 — 160.00 µg/mL; MIC and MBC for EFA were 7.07 — 160.00 µg/mL and 28.28 — 160.00 µg/mL; MIC and MBC for EFM were 16.82 µg/mL and 56.57 µg/mL. MIC of flavaspidic acid BB for MRSA1 — 2 and EFA14 — 15 were lower than that of mupirocin. Growth of MRSA2, EFA13 and EFM15 were inhibited by flavaspidic acid BB, which could delay the test bacteria entering the logarithmic growth phase. Clearance rates of MRSA2, EFA13 and EFM15 biofilms by flavaspidic acid BB (MIC) were respectively 85.15%, 76.48% and 82.31%, which were better than mupirocin, vancomycin and daptomycin. Clearing effect of flavaspidic acid BB on MRSA2 biofilm in accumulation and maturation stage were better than daptomycin, clearing effect of flavaspidic acid BB on EFA13 biofilm in accumulation and maturation stage were better than mupirocin, vancomycin and daptomycin, clearing effect of flavaspidic acid BB on EFM15 biofilm in maturation stage were better than mupirocin, vancomycin and daptomycin.Flavaspidic acid BB had a good antibacterial activityand clearing effect on biofilms.

gram-positive bacteria; flavaspidic acid BB; antibacterial agents; antibacterial activity; biofilm

R285.5

A

0253 - 2670(2021)08 - 2324 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.015

2021-01-08

国家重点研发计划“中医药现代化”重点专项项目（2018YFC1707100）；广东省科技厅应用型研发专项（2015B020234009）

莫梓童（1996—），女，硕士研究生，研究方向为中药提取分离技术与应用。E-mail: 805681335@qq.com

沈志滨（1964—），女，教授，博士，研究方向为中药药效物质基础及新药研发。E-mail: szb8113@126.com

[责任编辑 李亚楠]