一株降胆固醇菌株的筛选鉴定及安全性评价

谢晓娜，张元秋，杨郑州，侯保朝，廖丽琴

（1.百色学院农业与食品工程学院，广西百色533000；2.南阳市动物卫生监督所，河南南阳473000）

0 引 言

肠道菌群是指在人体肠道中长期定植，与宿主形成共生关系的菌群，数量达几十万亿到几百万亿，是人体细胞的10倍左右[1]，包括古生菌、细菌、真核生物以及病毒等，与宿主间存在复杂的相互关系[2]，肠道菌群与人体的相互作用对维持人体肠道微生态平衡及健康状况极其重要，且婴幼儿肠道中存在大量的益生菌，极具研究价值。

胆固醇在体内有多种生理功能，但摄入量过多会引起血脂过高，引发各种心血管疾病，对人类健康造成一定的威胁。随着近些年心血管疾病发病率的逐年攀升，降胆固醇成为研究热点，受到人们的密切关注，因此研究有效降胆固醇方法尤为重要。经研究发现乳酸菌具有降胆固醇的能力[3]，利用乳酸菌降胆固醇可以避免因药物治疗引发的一些副作用，并且可以治疗由降胆固醇药物引起的肠道菌群失调，在临床应用上有一定的优势，同时，乳酸菌还具有多种益生功能，有益于人类机体健康。

乳酸菌作为GRAS(Generally Regarded As Safe)级食品微生物，多年来数次应用于发酵食品中，安全可靠[4]。植物乳杆菌作为乳酸菌的一种，在欧盟具有一定的安全地位和食用安全史，广泛用于多种发酵食品中[5]。但仍有一些研究表明，乳酸菌会引起一些感染事件[6]。本实验对20株分离自婴幼儿粪便的乳酸菌进行体外胆固醇脱除能力的分析，筛选出一株具有显著降胆固醇能力的菌株，经鉴定为植物乳杆菌，若后续应用于发酵食品，对其安全性进行评价非常重要。因此对L.plantarum BS 09进行初步安全性分析，包括：抗生素敏感性分析、硝基还原酶活性分析、氨基酸脱羧酶活性分析、溶血试验分析、靛基质试验分析。初步确定L.plantarum BS 09为一株安全性乳酸菌，为其应用于发酵食品或是其他制剂的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20株分离自婴幼儿粪便的乳酸菌（本研究共收集6名4月龄左右婴儿的粪便样本，6名志愿者为女孩，志愿者的筛选要求是婴儿母亲的身体健康，在妊娠期间未服用过抗生素和益生菌，婴儿未补充益生菌制剂且没有胃肠病史，足月分娩，分娩方式为顺产，婴儿出生体重在正常体重范围内，婴儿出生后至采样前，只经母乳喂养，未摄入婴儿配方乳粉和其他辅食，婴儿未接受过抗生素治疗）；MRS培养基，北京索莱宝生物科技有限公司；细菌基因组DNA快速提取试剂盒，BioTeKe公司；胆固醇，美国Sigma公司；邻苯二甲醛、氢氧化钾、正己烷，氯化钠，天津致远化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器与设备

各种规格Eppondorf移液器，上海力申科学仪器有限公司；AE31型倒置显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；BCN 1360型生物洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造；低温冷冻离心机，上海离心机械研究所；快速混匀器，姜堰市新康医疗器械有限公司；Model 680酶标仪，美国Beckman公司；DH-101恒温鼓风干燥箱，青岛海尔集团公司；电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1体外降胆固醇菌株的筛选

1.3.1.1胆固醇标准曲线绘制

分别取胆固醇储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 m L于干净试管中，氮吹后先后加入邻苯二甲醛和浓硫酸，混匀，静置后，测定550 nm处吸光值，绘制标准曲线。

1.3.1.2胆固醇脱除率的测定

将20株从婴儿粪便中分离出来的乳酸菌活化两代后按照2%的接种量接种到MRS-CHOL-THIO培养基中，37℃培养24 h后4℃，5 000 rpm离心10 min，取1 mL上清液于干净试管中，加入95%乙醇4 mL和3 mL质量分数为33%的氢氧化钾溶液，在60℃水浴15 min后迅速冷却至室温，加入70%的正己烷10 mL，振荡分层后取3 mL上层正己烷，60℃氮吹，加入质量浓度0.5 mg/mL的邻苯二甲醛溶液5 mL，缓慢加入3 m L浓硫酸后摇匀，静置5 min，在波长550 nm处测定吸光值。根据标准曲线得出胆固醇浓度，并利用公式计算胆固醇脱除率。公式如下：

式中：C1为菌株接至M RS-CHOL-THIO培养24 h后上清液中胆固醇的质量浓度；C0为初始培养基中胆固醇的质量浓度。

1.3.2菌株的鉴定

对筛选出来的一株乳酸菌进行革兰氏染色，依次经结晶紫、碘液、95%乙醇、番红溶液染色、媒染、脱色、复染后，在1000倍显微镜下镜检。参照购买的DNA提取试剂盒说明书进行16SrDNA序列鉴定。将此株乳酸菌提取DNA后，利用通用引物扩增16S rDNA，引物序列如下：

上游引物27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'

下游引物1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGC C-3'

扩增后将PCR产物进行电泳检测，查看结果。将50μL扩增产物和通用引物进行双向测序，得到测序结果，利用NCBI网站数据库，进行Blast比对，鉴定菌株的属种。

1.3.3菌株安全性评价

1.3.3.1抗生素敏感性分析

（1）最小抑制浓度（MIC）测定

选用氯霉素、庆大霉素、万古毒素、红霉素、氨苄青霉素和四环素6种临床常用抗生素对菌株进行敏感性分析，分别配制含有以下浓度不同抗生素的MRS培养基：0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024μg/mL。将活化两代后的实验菌株以2%接种量接种至上述含有抗生素的培养基中，37℃培养24 h后观察结果，确定最小抑制浓度，以欧洲食品安全局（EFSA）制定的细菌对抗生素抗性的规定为标准进行比较评定[7]。

（2）质粒提取检测

提取实验菌株质粒，将提取的质粒溶液在琼脂糖凝胶中进行电泳，150 V，20 min，检测其有无质粒条带。

1.3.3.2硝基还原酶活性分析

将活化两代后的实验菌株接种至硝基还原酶检测培养基中，37℃培养24 h后，依次加入3～5滴α-萘胺溶液和对氨基苯磺酸溶液，观察颜色改变。若培养基变为红色，即为阳性；反之，则为阴性。以Escherichia coli ATCC 25922作为阳性对照菌株。

1.3.3.3氨基酸脱酸酶活性分析

对实验菌株在生长过程中是否产生酪胺（tyramine）、组胺（cadaverine）、尸胺（putrescine）和腐胺（histamine）4种生物胺进行检测。将活化两代后的实验菌株以2%接种量分别接种于4种氨基酸脱羧酶检测培养基中，37℃培养72 h后，观察颜色改变。若培养基变为紫色，即为阳性；反之，则为阴性。以Salmonella ATCC 14028作为阳性对照菌株。

1.3.3.4溶血实验分析

将活化两代后的实验菌株划线接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，37℃培养48 h，若出现草绿色溶血环，即为α-溶血；若出现无色透明的溶血环，即为β-溶血；若无溶血环，即为γ-溶血。以Staphylococcus aureus ATCC 25923作为阳性对照菌株。

1.3.3.5靛基质试验分析

将活化两代后的实验菌株接种至蛋白胨水培养基中，37℃培养24 h后，加入少量二甲苯，摇动试管提取靛基质，待其浮于培养基表面后沿管壁加入Kovacs试剂，观察二甲苯层颜色变化。若二甲苯层呈玫瑰红色，即为阳性；反之，则为阴性。以E.coli ATCC 25922作为阳性对照菌株。

1.3.4统计分析

实验数据均采用SPSS 18.0软件进行t检验及方差分析（ANOVA），检测差异显著性结果以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 降胆固醇菌株的筛选

胆固醇标准曲线如图1所示，线性回归方程为：y=0.0074x+0.0044，相关系数R2=0.9951,说明线性关系较好，标准曲线可用于胆固醇浓度测定。

图1 胆固醇标准曲线

图2 20株乳酸菌的胆固醇脱除率

由图2可以看出，20株乳酸菌均有一定的降胆固醇能力，但对胆固醇的脱除率各不相同。脱除率越大说明菌株体外降胆固醇能力越强。其中，胆固醇脱除率小于10%的有15株菌，占20株菌中比重相对较大；胆固醇脱除率在10%～30%之间的仅有4株菌，BS 09菌株的体外胆固醇脱除率最高为42.57%±4.29%。因此选择选取胆固醇脱除率最高的菌株作为后续实验研究对象。

2.2 菌株鉴定结果

活化两代后的实验菌株，经革兰氏染色后，在光学显微镜下观察，呈紫色，为革兰氏阳性菌。视野中呈现单一的形态，杆状，没有杂菌。镜检结果如图3所示，提取细菌基因组DNA后，利用通用引物对菌株进行扩增，产物电泳后成像结果如图4所示。将扩增后的产物和通用引物送至测序公司进行双向测序，得到测序结果，利用NCBI网站数据库，进行Blast比对，与植物乳杆菌同源性为100%，由此，确定该菌株为植物乳杆菌，将实验菌株命名为L.plantarum BS 09。

图3 乳酸菌镜检图

2.3 安全性评价结果

2.3.1抗生素敏感性分析

乳酸菌对抗生素敏感性的研究是评价菌株安全性的首要指标,本实验选取6种抗生素作为研究对象，其中包括抑制蛋白质合成的氯霉素、庆大霉素、红霉素、四环素和抑制细胞壁合成的万古毒素、氨苄青霉素，通过测定菌株MIC值判断其对不同抗生素的敏感性。将测定的MIC值与欧洲食品安全局（European Food Safety Authority,EFSA）定义的微生物截止值进行比较，MIC值小于或等于微生物截止值，说明菌株对抗生素敏感；MIC值大于微生物截止值，说明菌株对抗生素有抗性[8]。L.plantarum BS 09对6种抗生素的最小抑制浓度如表1所示。L.plantarum BS 09对氯霉素、庆大霉素、万古霉素、红霉素、四环素有抗性，对氨苄青霉素敏感。在乳酸菌耐药性近几年研究中，乳酸菌是否带有可转移性耐药基因引起人们的关注[9]。很多研究表明，乳酸菌的抗性主要来自于两种：固有和获得性，固有抗性是自身带有的，获得性抗性是从外源DNA获得的[10]。研究认为，多数乳酸菌的耐药性是非转移性的，但是与结合质粒相关的耐药性会有转移的可能。若菌株带有固有抗性，在临床应用上有一定的优势，可以改善由抗生素引起的肠道菌群紊乱。若菌株有获得性抗性，有将抗性转移到肠道致病菌中的风险。然而多数乳酸菌的抗性是固有抗性，非转移性的[11]，但与结合质粒相关的耐药性有转移的可能[12]。为了进一步研究L.plantarum BS 09对抗生素的抗性是否存在转移性，提取菌株质粒，通过电泳检测其是否存在质粒。质粒提取电泳结果如图5所示，通过对L.plantarum BS 09进行质粒检测，未出现条带，可以由此推测L.plantarum BS 09不含有耐药质粒，或是耐药基因存在于细菌DNA上，这两种情况都不会出现抗性转移，初步判定L.plantarum BS 09无抗性转移风险。

表1 植物乳杆菌BS09针对不同抗生素的MIC值结果 μg/mL

图5 质粒提取电泳

2.3.2硝基还原酶活性分析

对L.plantarum BS 09进行硝基还原酶活性分析，结果如图6所示。接种阳性对照菌株E.coli ATCC 25922的硝基还原酶培养基呈红色，为阳性；而接种L.plantarum BS 09的培养基未发生颜色变化。由此说明，L.plantarum BS 09不能产生硝基还原酶。当人体摄入含有硝酸盐成分的食物时，如果体内菌株含有硝基还原酶，会将硝酸盐还原为亚硝酸盐，进而转化成亚硝胺类物质，对人体有害[14]。因此检测菌株是否有硝基还原酶活性十分重要。本实验以E.coli ATCC 25922为阳性对照菌株，利用亚硝酸盐与对氨基苯磺酸和α-萘胺试剂反应生成红色重氮化合物的原理，对L.plantarum BS 09进行检测，结果呈阴性，说明其没有硝基还原酶活性。这与一些研究中植物乳杆菌没有硝基还原酶活性的结果一致[15]。

图6 硝基还原酶活性检测结果

2.3.3氨基酸脱羧酶活性分析

将L.plantarum BS 09和Salmonella ATCC 14028分别接种于4种氨基酸脱羧酶检测培养基中，培养后观察培养基颜色变化。结果如图7所示。接种阳性对照菌株Salmonella ATCC 14028的尸胺、腐胺检测培养基颜色呈现紫色，为阳性结果；而接种L.plantarum BS 09的酪胺、组胺、尸胺、腐胺检测培养基颜色均呈现黄色，为阴性结果。生物胺是一类有活性含氮低分子量的有机化合物，人体摄入过多会引起过敏反应，严重时会危及生命。一些研究表明[16]，一些乳酸菌在生长过程中会产生生物胺[17]。菌株若含有氨基酸脱羧酶，可将氨基酸脱羧成生物胺，因此对L.plantarum BS 09的氨基酸脱羧酶活性进行检测。本实验以Salmonella ATCC 14028作为阳性对照菌株，利用生物胺呈碱性，使指示剂溴甲酚紫呈紫色的原理，对L.plantarum BS 09进行检测，结果呈阴性，说明其生长过程中不会产生酪胺、组胺、尸胺和腐胺等有害代谢产物。这与其他研究发现植物乳杆菌较少有氨基酸脱羧酶活性相一致[18]。本实验中的L.plantarum BS 09为氨基酸脱羧酶阴性菌株，是否有减少或降低生物胺能力还有待于做进一步研究。

图7 氨基酸脱羧酶活性检测结果

2.3.4溶血试验分析

将L.plantarum BS 09和S.aureus ATCC 25923分别划线接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，培养后观察，结果如图8所示。S.aureus ATCC 25923菌落周围出现了透明圈，发生了β-溶血现象，而L.plantarum BS 09菌落周围无溶血环出现，为γ-溶血。由此说明，L.plantarum BS 09无溶血能力。溶血指红细胞破裂，可能引起的因素有：溶血性细菌、蛇毒侵入、输入配血不合的血液导致的抗原抗体反应、机械性损伤、红细胞内在缺陷等[19]。溶血性细菌可能会引起败血症，因此检测L.plantarum BS 09有无溶血性。本实验以S.aureus ATCC 25923为阳性对照菌株，在哥伦比亚血琼脂培养基上培养后，L.plantarum BS 09菌落周围没有溶血环出现，为γ-溶血，由此说明，L.plantarum BS 09不是溶血性细菌，不存在引起败血症的风险。与以往研究乳酸菌未检测出β-溶血现象一致[20]。

图8 溶血试验结果

2.3.5靛基质试验分析

对L.plantarum BS 09进行靛基质试验分析，结果如图9所示。接种阳性对照菌株E.coli ATCC 25922的检测培养基液面出现玫瑰红色，为阳性结果；而接种L.plantarum BS 09的培养基液面无玫瑰红色，为阴性结果。由此说明，L.plantarum BS 09不能产生色氨酸酶分解色氨酸生成吲哚。靛基质试验主要是检测菌株是否有色氨酸酶，将色氨酸分解成吲哚。色氨酸作为人体必需氨基酸之一，参与人体免疫、消化等多种过程[21]，色氨酸代谢障碍会引起恶性肿瘤、肝功能衰退等[22]。多数乳酸菌为靛基质试验阴性菌，但也有一些乳酸菌被发现为靛基质试验阳性菌[23]，因此对菌株进行靛基质试验检测十分必要。本实验以E.coli ATCC 25922为阳性对照菌株，检测发现L.plantarum BS 09为阴性结果，说明其不含有色氨酸酶。

图9 靛基质试验结果

3 结 论

本研究从20株婴幼儿粪便中分离出来的乳酸菌中筛选出降胆固醇能力相对较强的一株菌株BS 09，并通过菌株鉴定其为L.plantarum BS 09，通过安全性评价发现L.plantarum BS 09对氨苄青霉素未表现出抗性，对氯霉素、庆大霉素、万古霉素、红霉素和四环素表现出抗性，无抗性转移风险。此外，该菌株为硝基还原酶阴性、靛基质试验阴性，无溶血能力，不能产生tyramine、cadaverine、putrescine、histamin生物胺类物质，初步判定L.plantarum BS 09为一株安全的益生菌。此研究为功能性乳酸菌的进一步应用奠定了基础，同时为具有降胆固醇作用的L.plantarum BS 09菌株的进一步开发应用提供了理论参考。