肾上腺切除对昆明小鼠免疫功能的影响*

王玉辉， 李智渊， 刘 慧， 沈 今， 朱珍琴， 张 金， 徐德立

(曲阜师范大学生命科学学院，273165，山东省曲阜市)

动物的免疫系统在防御环境中的病原体如病毒、细菌和真菌等方面发挥着重要作用[1-3].动物的免疫能力受多种激素的影响，其中肾上腺分泌的糖皮质激素是通过内分泌途径调节免疫反应的重要激素[4].应激环境下肾上腺糖皮质激素的分泌通常会增加，而糖皮质激素等应激激素往往会抑制动物的免疫反应[4-7].

研究发现，肾上腺切除可以减弱SD(Sprague-Dawley)大鼠的先天免疫力，同时在创伤中表现出炎症反应和组织损伤[8].肾上腺切除后，瑞士白化小鼠(Swissalbino)的血液学参数，如血红蛋白浓度，红细胞压积值，总白细胞计数增加[9].肾上腺切除后，Balb/c大鼠体液免疫指标如IL-2、胸腺系数、血清IgG含量明显升高[10].动物的应激反应主要由糖皮质激素如皮质酮介导，以对抗具有挑战性的环境条件[11].例如，部分皮质酮耗竭的大鼠显示出降低的细胞内杀伤能力[9]，补充外源性皮质酮使小鼠胸腺重量减轻90%，而橙腹草原田鼠(Microtusochrogaster)胸腺降低37%[12-13].急性应激使雄性大鼠血浆皮质酮升高，先天免疫功能下降[14].皮质酮还能降低雏鸡胸腺和脾脏的相对重量[15].补充皮质酮会降低鸟类的体液免疫，但不影响其细胞免疫能力[16-19].皮质酮也会抑制野生鸟类如褐头牛鹂(Molothrusater)、家麻雀(Passerdomesticus)的先天免疫活性，并且增加感染风险[20-22].其他研究发现，皮质酮处理对雄性大鼠的PHA反应影响较小，对雌性大鼠的PHA反应没有显著影响[23].皮质酮对免疫反应的影响可能与其剂量有关，例如，小剂量皮质酮或肾上腺素可显著增强SD大鼠反映细胞免疫能力的迟发型超敏反应(Delayed Type Hypersensitivity,DTH)，而大剂量皮质酮则显著抑制皮肤的DTH[24].因此对皮质酮的研究还需在多个物种中展开.

细胞免疫是动物适应性免疫的组成部分，主要防御细胞内病原体如病毒等，常用植物血凝素反应进行评估[25-27].免疫器官如胸腺和脾脏也可以反映动物的免疫能力，通常情况下，免疫器官越重，免疫能力越强[28-30].

为了研究肾上腺在动物免疫功能中的作用，我们将雌性昆明小鼠分为肾上腺假切除组和肾上腺切除组，肾上腺切除后可能会导致皮质酮分泌减少，因此，我们预测，肾上腺切除后昆明小鼠细胞免疫反应增强，免疫器官如脾脏和胸腺的重量会增加.

1 材料与方法

1.1 实验设计

本实验所用的动物为雌性昆明小鼠，年龄为3月龄，购自济南朋悦动物有限公司，小鼠单笼(规格：30 cm×15 cm×20 cm)饲养，自由取食和饮水，温度为23±1 ℃，光周期为12L:12D(Light:Dark)，饲料是标准的大小鼠饲料(北京科奥协力饲料有限公司)，垫料为锯末，昆明小鼠饲养至体重稳定后，将14只昆明小鼠随机分为肾上腺假切除组(Adrenal sham removed group,ASR,n=8)和肾上腺切除组(Adrenal removed group,AR,n=6)，每3天测定一次体重(精确到0.1 g)，肾上腺切除后第34天处死动物.

1.2 肾上腺切除

实验用具如手术、剪刀、缝合针线、镊子等洗净干燥后进行高温灭菌，实验还需要酒精、麻醉剂、手术板等实验用品.昆明小鼠用0.5%的戊巴比妥钠采用腹腔注射方式进行麻醉，然后在手术板上固定好昆明小鼠.用75%酒精对小鼠的腹中部处进行消毒，再用酒精棉签对手术缝合针、剪刀以及镊子消毒.用手术剪刀在腹中部靠近肾脏处剪开一小块皮肤，迅速找出肾脏，用镊子小心将肾脏露出，找到肾上腺，小心地切除.检查好之后，立刻用手术缝合针将剪开部位小心缝合，注意速度快并且要将伤口缝合紧密，用酒精擦拭伤口消毒，然后把动物放回鼠盒中，让其身体恢复一周.

1.3 细胞免疫

肾上腺切除后第31天，测定PHA反应.测定方法为用酒精对小鼠左后足足垫处进行消毒，用数显电子测微尺(精确度为± 0.01 mm)测定小鼠左后足足垫处的厚度，之后，在小鼠左后足足垫中央部分注射0.03 mL PHA溶液(将25 mg PHA溶于7.5 mL无菌磷酸缓冲液)，在注射之后6 h、12 h、24 h、48 h，分别测定小鼠左后足足垫中心处的厚度，每只动物每个时间点测量6次，计算平均值.PHA反应的计算方法为：(注射PHA后的足垫平均厚度-注射PHA前的足垫平均厚度)/注射PHA前的足垫平均厚度[26-27].

1.4 身体成分与器官

肾上腺切除后第34天，将昆明小鼠进行颈部取血处死，然后根据文献中的方法解剖小鼠[7].具体来说，用手术剪将小鼠腹腔和胸腔小心剪开，然后将心脏、胸腺、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏、肾上腺、性腺等小心地取出，将器官周围的结缔组织小心地剔除，器官表面的液体等用吸水纸吸干，用电子天平(0.0001 g)称量.取出小鼠的消化道，将肠系膜脂肪(附着在消化道周围的脂肪)取出，将消化道展开，仔细分辨出胃、盲肠、小肠以及结肠的位置，展开并测量消化道各部分的长度及重量，将消化道各部分纵向剖开，分离出消化道内容物，用生理盐水清洗后再次进行称重，即消化道鲜重.将小鼠脑和下丘脑取出称重，并分离出肩胛间褐色脂肪组织(IBAT)、皮下脂肪、腹膜后脂肪，皮下脂肪、腹膜后脂肪和肠系膜脂肪总重为脂肪总重，皮下脂肪、腹膜后脂肪、肠系膜脂肪分别除以小鼠的脂肪总重即为每部分的脂肪含量[31-32].

1.5 数据分析

利用SPSS 18.0软件进行数据统计分析.首先确定实验数据是否符合正态分布，采用One-sample Kolmogorov-Simirnov test进行检验，采用多因变量协方差方法(General Linear Model Multivariate)以体重为协变量分析器官鲜重，采用独立样本t-检验(Independent-samplest-test )分析小鼠的身体成分、PHA反应，利用重复测量的方差分析(repeated measurement analysis)分析体重以及PHA反应随时间的变化，数据采用平均值±标准误(Mean±SE)表示，P<0.05表示统计学差异显著，P<0.01表示统计学差异极显著.

2 结 果

2.1 体重

在小鼠切除肾上腺前，对两组小鼠进行称重，Day1(t=-0.329,df=12,P=0.748)，Day4(t=-0.55,df=12,P=0.592)，Day7(t=-0.444,df=12,P=0.665)，数据表明肾上腺切除组和肾上腺假切除组之间在体重方面无显著差异，切除肾上腺后，切除肾上腺对Day15(t=0.541,df=12,P=0.598)到Day45(t=0.643,df=12,P=0.532)之间的体重均无显著差异(图1).体重随处理时间显著增加(F13,156=14.096,P<0.001)，而时间与组别无交互作用(F13, 156=0.920,P=0.534).肾上腺假切除组体重随时间显著增加(F13,91=14.341,P<0.001).肾上腺切除组体重也随时间显著增加(F13,65=3.816,P<0.001).

图1 切除肾上腺对昆明小鼠体重的影响

2.2 身体成分

切除肾上腺对昆明小鼠的初始体重、终体重、胴体湿重、皮下脂肪及含量、腹膜后脂肪及含量、肠系膜脂肪及含量以及总脂重均无显著差异(表1).

表1 切除肾上腺对昆明小鼠身体成分的影响

2.3 器官鲜重

切除肾上腺对昆明小鼠的脑、下丘脑、IBAT、心脏、肺脏、肝脏、肾脏、胃、小肠、盲肠、结肠长度及内容物、总消化道长度均无显著差异(表2).

表2 切除肾上腺对昆明小鼠器官鲜重的影响

2.4 免疫器官

切除肾上腺显著增加了小鼠胸腺鲜重(F1,11=5.113,P=0.045)，但不影响脾脏鲜重(F1,11=0.113,P=0.743)(图2 A,B)，小鼠的胸腺(r=0.072,P=0.807)和脾脏(r=0.029,P=0.920)与脂肪总重不具有相关性.

图2 切除肾上腺对昆明小鼠胸腺(A)和脾脏(B)的影响，柱子上不同字母表示组间差异显著

2.5 细胞免疫反应

切除肾上腺对注射PHA后的6 h(t=-0.393,df=12,P=0.701)、12 h(t=1.234,df=12,P=0.241)、24 h(t=-1.586,df=12,P=0.142)、48 h(t=-1.708,df=12,P=0.116)均无显著影响(图3)，脂肪总重与注射PHA后的6 h(r=-0.384,P=0.175)、12 h(r=-0.078,P=0.791)、24 h(r=-0.228,P=0.434)、48 h(r=0.165,P=0.572)均不具有相关性.PHA反应随处理时间显著降低(F3,36=37.493,P<0.001)，而时间与组别无交互作用(F3,36=2.281,P=0.096)，肾上腺假切除组PHA反应随时间显著降低(F3,21=27.206,P<0.001)，肾上腺切除组PHA反应也随时间显著降低(F3,15=14.379,P<0.001).

图3 切除肾上腺对昆明小鼠PHA反应的影响

3 讨 论

肾上腺切除对昆明小鼠不同的免疫指标影响不同，肾上腺切除后胸腺鲜重显著增大，对脾脏鲜重和PHA反应则没有影响.

3.1 肾上腺切除对昆明小鼠体重、身体成分和器官的影响

切除肾上腺对昆明小鼠的体重没有显著影响，这与切除肾上腺的Waster大鼠体重下降的结果不同[33].不同的实验方式，动物的种类、实验条件以及处理方式的不同可能是造成这些差异的原因.本实验中，切除肾上腺不影响昆明小鼠的皮下脂肪及含量、腹膜后脂肪及含量、肠系膜脂肪及含量、总脂肪重以及胴体湿重，切除肾上腺对大多数器官鲜重包括脑、肺脏、肾脏、心脏、小肠重量及长度、盲肠重量及长度、结肠重量及长度、消化道总长均无显著影响.

3.2 肾上腺切除对昆明小鼠免疫功能的影响

切除肾上腺后显著增加了胸腺鲜重，可能与肾上腺切除导致皮质酮浓度降低，免疫功能抑制作用被解除有关，这与Balb/c小鼠、Waster大鼠的研究结果一致[10,34,35].此外，切除肾上腺均不影响6 h、12 h、24 h、48 h后的PHA反应，前人研究发现，补充皮质酮对雄性大鼠的PHA反应影响较小，不影响雌性大鼠的PHA反应[23]，不同浓度的皮质酮补充对雄性斑马雀(Pseudotropheuslombardoi)的PHA反应没有影响[36]，因此，切除肾上腺后皮质酮浓度变化对PHA反应影响较小.前人研究显示，肾上腺切除可消除应激引起的DTH增强.急性给予肾上腺切除动物生理浓度的皮质酮可增强皮肤DTH[24]，与假切除组相比，切除肾上腺的SD大鼠注射KLH(Keyhole-Limpet-Hemocyanin)后的IgG、IgM反应降低，补充生理剂量的皮质酮后的肾上腺切除大鼠部分恢复了抗KLH-IgM，但仍抑制了抗KLH-IgG[37].可见，切除肾上腺或补充皮质酮对免疫功能的影响与检测的免疫指标、动物品种的不同有关，因此，切除肾上腺或补充皮质酮对免疫功能的影响需要进一步研究.

生物体的能量贮存是影响动物免疫能力强弱的重要因素之一.已经证明，脂肪不仅可以为动物的生存提供能量，还是动物体内重要的免疫器官和内分泌器官[38-42].低能量储备的动物比高能量储备的动物分配更少的能量用于免疫防御.因此，体脂质量的减少会损害免疫力[7,43,44].切除肾上腺不影响小鼠的皮下脂肪及含量、腹膜后脂肪及含量、肠系膜脂肪及含量、总脂肪重，脾脏鲜重和PHA反应与总脂重不存在相关性，胸腺鲜重与总脂肪重也不存在相关性，表明胸腺鲜重的增加可能与脂肪无关.

切除肾上腺后，皮质酮分泌相应减少，这可能是动物免疫功能增强的原因[45-46].皮质酮是否介导了昆明小鼠的免疫能力的强弱，其内在机制还需要进一步研究.

总之，切除肾上腺对昆明小鼠不同的免疫指标影响不同，胸腺鲜重显著增加，细胞免疫和脾脏鲜重不受切除肾上腺影响，因此，切除肾上腺是否会导致血液皮质酮浓度的降低进而影响免疫功能，还需要进一步研究.