丁酸梭菌早期干预对幼龄番鸭生长性能、肠道黏膜形态及肠屏障功能的影响

李 娜，杨 华，吕文涛，王兴鑫，卢立志，肖英平*

（1.浙江农林大学动物科技学院，浙江杭州 311300；2.省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室（筹），浙江杭州 310021；3.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021）

番鸭作为一种重要的经济动物，番鸭肉具有独特的风味深受消费者喜爱，因此人们对鸭肉的需求也逐年增加。据中国畜牧业协会与世界粮农组织（FAO）数据统计，2019 年中国肉鸭年出栏约42.68 亿只，约占全球肉鸭出栏量的68%[1]。其中番鸭在2019 年的出栏量为5.31 亿只，占肉鸭总出栏量的16.2%[2]。

肠道是机体最大的消化系统，也是重要的黏膜屏障，在肠道免疫和稳态中起着重要作用[3]。完整的肠道屏障结构可以保证其功能的完善，这通常是通过肠绒毛长度和隐窝深度来体现[4]。肠道屏障包括物理屏障、消化吸收、免疫调节等多种生理功能，而紧密连接是肠屏障的组成部分，主要包括Claudin、ZO等[5-6]。紧密连接通常被认为是评价肠道通透性及完整性的重要指标[7-8]。通过对幼龄动物肠道菌群的早期干预会对其肠道黏膜形态和紧密连接蛋白表达起到积极的调控作用，如Yin 等[9]、Gong 等[10-11]、Li 等[12]都通过灌服盲肠内容物发酵液进行早期干预，发酵液中复合益生菌率先定殖于肠道中从而精准地发挥益生效果，被视为一种新的调节家禽生长和机体健康的策略。丁酸梭菌能够调节机体肠道酸性环境，维持肠道内环境稳态、减轻炎症反应，被做为饲料添加剂广泛使用[12-15]。丁酸梭菌通过代谢产生丁酸来修复受损的肠屏障，并通过上调ZO-1和Claudin-1的表达来修复受损的肠上皮细胞[16]。虽然目前有大量关于丁酸梭菌在畜禽动物作用的研究报道，但主要集中于在饲料中添加使用[17-19]。目前是否可以在幼龄动物肠道微生物定植发育的窗口期阶段，通过益生菌早期干预来定向改变微生物的发育演替，从而改善动物的生产性能目前并不清楚。本研究以典型的饲用益生菌——丁酸梭菌为研究对象，选择番鸭为研究模型，通过丁酸梭菌早期灌服探讨其早期干预对幼龄番鸭体重、肠道黏膜形态及肠道紧密连接蛋白表达的影响，以期丁酸梭菌等益生菌的应用和番鸭养殖提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计 在兰溪禾旺禽业专业合作社选用160 只1日龄、体重（47.3±3.9）g 的初出壳番鸭，随机分为2 组，每组8 个重复，每个重复10 只。丁酸梭菌组于刚出壳2 h内每只灌服1 mL 丁酸梭菌菌液（≥2×109CFU/mL），连续灌服3 d；对照组每只灌服1 mL 生理盐水。日粮组成和营养成分见表1。自由采食饮水。饲养周期为2 周。

丁酸梭菌菌液制备：菌株购于日本米雅利桑制药株式会社生产企业生产的酪酸杆菌活菌片；取20 mg 丁酸梭菌于用50 mL MRS 肉汤中，37℃厌氧培养24 h，制备成活菌数≥2×109CFU/mL 的菌液。

表1 日粮组成及营养成分

1.2 饲养管理 番鸭饲养于浙江省农业科学院实验动物房内。提前1 周对实验动物房及其他饲养设备进行彻底打扫和消毒。试验期间人工投喂，自由采食和饮水。第1 周温度控制在32℃左右，第2 周温度控制在30℃左右。

1.3 生长性能测定 于第7、10、14 日龄当天早晨空腹称重，并记录采食量，计算平均日采食量和耗料增重比，参照标准《家禽生产性能名称术语和度量统计方法》（NY/T 823-2004）进行生长性能测定，计算公式：

1.4 样品采集及肠道黏膜形态测定

1.4.1 样品采集 在第7、10、14 日龄进行采样，每个重复随机挑选1 只番鸭进行屠宰，解剖后迅速分离肠道，剪取1 cm 左右回肠组织（回肠中段）于4% 多聚甲醛中固定，用于制备切片；另取回肠及盲肠肠段立即冷冻至液氮，随后转移到-80℃冰箱保存。

1.4.2 肠道黏膜形态测定 取样修整，脱水，包埋，切片，染色，每个样本切片做3 个重复。应用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA） 软件以200 倍标尺（200 μm）为标准进行拍照分析绒毛高度（VH）和隐窝深度（CD）。并计算绒毛高度与隐窝深度的比值（VH/VD）。

1.5 肠道紧密连接蛋白表达量分析

1.5.1 总RNA 提取及cDNA 的合成 采用TRIzol®Plus RNA Purification Kit（Thermo Fisher）和SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Thermo Fisher）对回肠和盲肠组织分别进行总RNA 提取以及第一链cDNA 合成，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.5.2 RT-PCR 选取GAPDH为内参基因，采用Primer Premier 6.0 软件设计引物，由生工生物工程股份有限公司（上海）负责合成（表2）。反应条件：95℃预变性1 min；95℃变性10 s，60℃退火延伸25 s，进行40 个循环。每个样本设置3 个复孔，采用2-ΔΔCt法基因相对表达量。

1.6 统计分析 用SPSS 19 软件进行T 检验，结果以平均值± 标准差表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著，并用GraphPad Prim6 进行作图分析。

2 结果

2.1 丁酸梭菌早期干预对幼龄番鸭生长性能的影响 由表3 和表4 可知，与对照组相比，丁酸梭菌早期干预后番鸭体重在7、10 和14 日龄略有升高（P＞0.05）；平均日采食量、耗料增重比在1～7、8～10、11～14 日龄均降低（P＞0.05）。

表2 RT-PCR 引物序列与参数

表3 丁酸梭菌早期干预对番鸭体重的影响 g

表4 丁酸梭菌早期干预对番鸭平均日采食量和耗料增重比的影响

2.2 丁酸梭菌早期干预对对番鸭肠道黏膜形态结构的影响 由图1 可以看出，对照组在第7 日龄肠道绒毛顶端上皮脱落较为严重且绒毛密度较低，而第10 和14 日龄丁酸梭菌组比对照组绒毛更密集，绒毛高度相对较高，并且完整性也更好。由表5 可知，在第7 日龄丁酸梭菌组VH 和VH/CD 较对照组均显著增加，而CD 显著降低；第10 日龄丁酸梭菌组VH 以及VH/CD 显著增加，CD 无显著性影响；第14 日龄两组VH、CD 以及VH/CD 均无显著性差异。

2.3 丁酸梭菌早期干预对对番鸭回肠紧密连接蛋白表达的影响回肠 如图2 所示，与对照组相比，在第7 日龄，丁酸梭菌组Claudin1基因相对表达水平上调了111%（P=0.011）、Claudin2 表达上 调111%（P=0.000）、ZO-1表达上调132%（P=0.011）、ZO-2表达上调143%（P=0.002）。在第10 日龄，丁酸梭菌组Claudin1基因相对表达水平上调了111%（P=0.02）、Claudin2表达上调243%（P=0.024）、ZO-2表达上调108%（P=0.027）。而4 种基因相对表达水平在第14 日龄时均无显著性差异。

图1 回肠黏膜切片分析

2.4 丁酸梭菌早期干预对对番鸭盲肠紧密蛋白表达的影响 如图3 所示，与对照组相比，在第7 日龄，丁酸梭菌组Claudin2基因相对表达水平下调65%（P=0.010）；Claudin1、ZO-1和ZO-2相对表达水平均无显著性差异。在第10 日龄，丁酸梭菌组Claudin2基因相对表达水平上调46%（P=0.009）；Claudin1、ZO-1和ZO-2相对表达水平无显著性差异。在第14 日龄，丁酸梭菌组Claudin2基因相对表达水平上调131%（P=0.018）；Claudin1下调51%（P=0.106）、ZO-1和ZO-2相对表达水平无显著性差异。丁酸梭菌组Claudin1、ZO-1和ZO-2相对表达水平在第7、10 和14 日龄差异均不显著。

3 讨 论

已有大量研究表明，丁酸梭菌能够促进畜禽的生长性能，有助于机体健康。丁酸梭菌能够提高肉鸡的生长性能、显著影响断奶仔猪的平均日增重、显著增加北京鸭体重[17-19]。本研究中，早期灌服丁酸梭菌后，番鸭体重有上升趋势，且能够在一定程度上降低番鸭的平均日采食量及耗料增重比，表明丁酸梭菌早期干预对番鸭生长性能有着积极作用。

小肠是动物机体消化吸收的主要部位，完整的肠道结构对动物的消化吸收具有重要意义，这与小肠VH 和CD 的形态特征密切相关[20-21]。同时动物机体健康在很大程度上依赖于复杂的肠道系统，包括肠道形态及肠屏障功能的完整性[4]。其中VH 对营养物质的吸收发挥着重要作用，CD 代表了上皮细胞的成熟状态，而VH/CD越大表明小肠的吸收能力越好[22]。已有研究表明，小肠VH 升高有助于对营养物质的运输和吸收[23]，丁酸梭菌能够显著影响小肠VH 以及VH/CD[24-25]，这与本研究的结果一致，第7 日龄丁酸梭菌组回肠的VH、VH/CD 均显著升高，CD 显著降低；第10 日龄回肠VH 也显著升高。主要原因可能是丁酸梭菌产生的丁酸能够提供营养物质来修复和再生肠道上皮细胞[26]。由此可见，早期灌服丁酸梭菌有助于番鸭小肠形态的发育并改善肠道黏膜结构，特别是VH；从而有助于提高番鸭肠道对营养物质的代谢和消化吸收，促进机体的生长发育。

表5 丁酸梭菌早期干预对肠道黏膜形态的影响

图2 丁酸梭菌早期干预对番鸭回肠紧密连接蛋白表达的影响

图3 丁酸梭菌早期干预对番鸭盲肠紧密连接蛋白表达的影响

肠道屏障作为维护肠道不受外界致病因子侵害的第一道防线，对保护机体健康有着重要意义[27]。Claudin和ZO是紧密连接的主要组成部分，参与维持细胞极性、结构完整性、黏附作用以及紧密连接屏障的功能[15,28]。本研究采用qRT-PCR 技术来阐明早期灌服丁酸梭菌对番鸭回肠和盲肠中紧密连接蛋白基因(Claudin1、Claudin2、ZO-1和ZO-2) 的相对表达水平的影响，结果表明，早期灌服丁酸梭菌能够在第7 日龄和第10 日龄显著上调回肠中4 种紧密连接蛋白基因的表达，以及在第14 日龄有上调趋势。已有研究结果也表明，丁酸梭菌在肠道中产生丁酸，可为肠上皮细胞提供能量，能够显著提高Claudin和ZO的表达，并在肠道屏障的形成和调节中起重要作用[26,29]。而在盲肠中，与对照组相比，丁酸梭菌组Claudin1、ZO-1和ZO-2相对表达水平在第7、10 和14 日龄差异均不显著；Claudin2相对表达水平在第7 日龄显著降低，第10 日龄极显著升高，在第14 日龄时显著升高，这可能是在7 日龄阶段盲肠微生物仍然处于动态演替的发育性变化中，丁酸梭菌干预使得菌群结构发生变化，影响宿主的基因表达[30-31]，从而短时期内影响了Claudin2表达，由此说明丁酸梭菌早期干预主要是提高回肠紧密连接蛋白基因的表达，具体原因有待进一步研究。

4 结 论

通过对刚出壳（1 日龄）番鸭进行连续3 d 丁酸梭菌（2×109CFU/mL）早期干预能够显著提高7～10 日龄番鸭回肠VH，降低CD 以及VH/CD，还能提高回肠紧密连接蛋白Claudin1、Claudin2、ZO-1和ZO-2的相对表达水平，改善肠道形态及屏障功能，从而对动物机体健康、生长发育和生长性能有一定促进作用。