甘草地上部分不同提取方法提取物成分HPLC-MS/MS分析*

张玥辉，薄颖异，王文全，，4，常冠华，王文地，崔洁，侯俊玲，4，谭卫忠

（1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.天津市宝坻区人民医院药剂科，天津 301800；3.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；4.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京102488；5.国药控股济南有限公司，济南 250100）

甘草地上部分为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎[1]。甘草在中医药中使用非常广泛，在中国进行了大量广泛的栽培种植。甘草地上部分作为非传统药用部位，目前主要做饲料用或焚烧处理，并没有很好的加以开发利用。经研究发现，其提取物对前列腺炎有一定的治疗作用[2]，其乙醇提取物有较好的抗氧化能力[3]。

高效液相色谱二级质谱（HPLC-MS/MS）技术作为一种物质分析手段，同时发挥了液相的高分离度和质谱的高灵敏度和强定性专属性的特点，在药学研究、食品安全等各种领域中广泛应用[4-5]。在近年针对甘草地上部分的成分鉴定和分离等研究中，HPLC-MS/MS技术也发挥了重要的作用[6-7]。本实验使用HPLC-MS/MS技术，对甘草地上部分不同提取方法制备的提取产物的化学组成进行了分析鉴定。同时通过查阅文献，对其中部分物质的药理活性进行了梳理总结，以便有效指导下一步的分离富集工艺优化研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters Acquity Xevo G2 QTof质谱；Waters Acquity超高效液相系统；超临界萃取（北京化工集团）；电子调温电热套（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药 水（娃哈哈集团有限公司）；乙醇（分析纯，北京化工厂）；甲酸（色谱纯，Fisher Scientific）；乙腈（色谱纯，Fisher Scientific）；

1.3 材料 甘草地上部分样品2018年9月采集于甘肃省酒泉市瓜州县河东乡，经北京中医药大学王文全教授鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的地上部分，阴干，粉碎，过40目筛，备用。

2 方法

2.1 样品制备方法

2.1.1 水提物制备方法 取甘草地上部分粉末，用去离子水回流提取，料液比1∶6，提取时间90 min，提取两次。提取液干燥，得到水提物。

2.1.2 醇提物制备方法 取甘草地上部分粉末，用70%乙醇回流提取，料液比1∶6，提取时间90 min，提取两次。提取液干燥，得到醇提物。

2.1.3 CO2超临界萃取物制备方法 取甘草地上部分粉末，无水乙醇作夹带剂，液料比15%，提取时间90 min，提取两次。28 kPa，50℃，CO2流量 12 kg/h萃取，6 kPa，46.8℃分离。过滤，合并滤液，干燥，得到CO2超临界萃取物。

2.2 HPLC分析检测方法Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：以乙腈-0.5%甲酸水为流动相，（乙腈：0～5 min，10%～15%；5～25 min，15%～35%；25～40 min，35%～60%；40～50 min，60%～85%）；体积流量为 1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量 10 μL；检测波长为280 nm。

2.3 质谱检测分析方法 电喷雾离子（ESI-）源，源温度为100℃，脱溶温度400℃，毛细管电压2.5 kV，提取器电压为40 V，锥孔气体流量为为50 L/h，脱溶气体流量为800 L/h，质量扫描范围为m/z 100～1500。

3 结果与分析

3.1 水提物主要成分分析 经过高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF/MS）分析，HPLC色谱图（上）及总离子流图（下），见图1。具体数据，见表1。共定性9个化合物，其中5个黄酮醇苷类化合物，3个黄酮苷类化合物，1个异黄酮苷类化合物。

图1 水提物HPLC图（上）及总离子流图（下）

表1 水提物质谱信息

3.2 醇提物主要成分分析 经过高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF-MS）分析，HPLC色谱图（上）及总离子流图（下），见图2。具体数据，见表2。共定性14个化合物，其中两个黄酮醇苷类化合物，两个黄酮类化合物，两个二氢黄酮类化合物，两个异戊烯基黄酮醇类化合物，两个二氢芪类化合物等。

图2 醇提物HPLC图（上）及总离子流图（下）

表2 醇提物质谱信息

3.3 CO2超临界萃取物主要成分分析 经过HPLC-Q-TOF-MS）分析，HPLC色谱图（上）及总离子流图（下）如图3。具体数据，见表3。共定性10个化合物，其中两个黄酮类化合物，两个二氢黄酮类化合物，1个查尔酮类化合物，4个异戊烯基黄酮醇类化合物，1个二氢芪类化合物等。

图3 CO2超临界萃取物HPLC图（上）及总离子流图（下）

表3 CO2超临界萃取物质谱信息

本实验通过对二级质谱碎片图谱的分析，及查阅对比文献，对目前已报道的甘草地上部分黄酮类成分进行了分析定性。并根据所得信息分析了各提取物中有代表性的物质的裂解过程。

夏佛塔苷的一级质谱中，m/z 563为它的[M-H]-，其主要特征离子为：m/z443（己糖 0-2，120）、473（己糖0-3，90）、353（120+90）、383（120+60）和 503（60）[12]。见图4。

图4 夏佛塔苷裂解规律

槲皮素-3-O-葡萄糖苷糖链主要以均裂的方式脱去，一级质谱中，m/z 463为它的[M-H]-，脱去m/z 163葡萄糖（C6H11O5）产生的m/z 300的相对强度强于m/z 301，还可以观察到m/z 271[11]。见图5。

图5 槲皮素-3-O-葡萄糖苷裂解规律

乌拉尔宁的一级质谱中，m/z 355为它的[M-H]-，其主要特征离子有：m/z300（M-C4H8），m/z204（1，3B），m/z179（M-B），m/z148（204-C4H8），m/z107（0，4A-）[49]。见图6。

图6 乌拉尔宁裂解规律

4 结论与讨论

本研究中发现，甘草地上部分主要含有以黄酮类物质为主的各种成分。通过水提取、乙醇提取和CO2超临界萃取的方法，获得了3种不同的提取物。水提物中含有的物质极性较大，其中主要含有黄酮（醇）苷类物质。醇提物极性相对较小，其中主要含有黄酮（醇）苷元类物质。醇提物和水提物中含有相同的2种物质，其余物质均不同。CO2超临界萃取物的极性最小，其中含有相对更多的异戊烯基黄酮类物质。CO2超临界萃取物与水提物没有相同物质，与醇提物有5种相同物质相同。

水提取和乙醇提取均属于溶剂提取，依据相似相溶的原理，提取出与和溶剂极性接近的物质。有操作简单，溶剂廉价环保等特点，是实验室研究中常用的提取方法。超临界萃取是一种更高效的现代提取方法，利用超临界状态CO2的高扩散系数，提取出更多的有效成分，常温常压下CO2易挥发，减少提取溶剂在提取物中的残留[50]。适合提取小极性物质、挥发油等。但是有成本高、操作复杂的问题。

黄酮（醇）苷和黄酮（醇）苷元两类物质性质较为相近，主要有抗炎和抗氧化的活性。黄酮苷和黄酮苷元在结构上的区别，导致的在体内代谢过、吸收过程会有不同。醇提物和CO2超临界萃取物中也含有部分有异戊烯基结构的物质，异戊烯基黄酮拥有广泛的生物活性，主要有抗炎和免疫调节、心血管保护、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老及生殖作用等药理活性。可以尝试调整方法，针对性地对甘草地上部分中更小极性部位进行富集，或者进一步的开发。本实验中的提取方法及结果可以为进一步的药效研究提供依据。

本实验主要使用了文献对比分析的方法进行物质鉴别，对于部分同分异构体的鉴定可能不够准确。因此，在下一步的研究中，将通过分离纯化方法获得单体，或者购买相应标准品，再使用HPLC技术进行验证。药理活性部分仅进行了文献整理，更多物质的更多药理活性还有待探索发现。