牛黄镇惊丸中黄曲霉毒素残留检测方法研究

刘雅丹,李静,张聿梅,王菲菲,于欣

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

动物源性或植物源性中药在生长、加工、贮藏和运输过程中均可能被真菌污染[1]。其中，黄曲霉是我国粮食和饲料中常见的真菌，它的次生代谢产物黄曲霉毒素(aflatoxins，AFs)，具有致癌、致畸、致突变和强烈的肝脏毒性[2-4]。黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前毒性最强、分布最广、含量最高的Ⅰ类致癌物，它可以通过食物链在生物体之间转移，对人类健康产生了严重的危害[4]。中药材主要来源于天然产物，不可避免地会感染黄曲霉。一般认为，动物源性中药材受潮霉变的概率高于植物源性中药材[2]。因此，检测动物源性中药材或含动物源性中成药中黄曲霉毒素的残留量，对于确保临床用药安全至关重要。在《中国药典》2015年版(一部)中，陈皮、大枣、地龙、蜈蚣、水蛭、全蝎、僵蚕等20余味药材及其饮片均有黄曲霉毒素的检查项，其要求为： AFB1含量不得超过5 μg·kg-1,B1、B2、G1和G2总含量不得超过10 μg·kg-1[7]。

牛黄镇惊丸(大蜜丸)是一种常见的中成药制剂，收载于《中国药典》年版2015年版(一部)，处方由牛黄、全蝎、炒僵蚕、天麻、钩藤、防风、胆南星、制白附子、天竺黄、薄荷和甘草等十八味中药材原料组成，临床主要治疗小儿惊风，高热抽搐，烦躁不安等症状[7]。本文针对牛黄镇惊丸中动物源性和植物源性中药材进行黄曲霉毒素检测，评估牛黄镇惊丸的黄曲霉毒素残留的风险。

目前针对中药中黄曲霉毒素检测的方法，主要为薄层色谱法、免疫亲和柱-高效液相色谱方法(IAC-HPLC)、液相串联质谱法(HPLC-MS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)等[1,5]。然而，这些方法操作较为复杂，需要专业的实验室和操作人员完成试验。为了适应现场快速检查的需要，本文采用免疫胶体金方法(GICA)对牛黄镇惊丸样品的黄曲霉毒素的残留量进行快速筛查。GICA方法可以在非实验室条件下简单快速地检测样品中真菌毒素的残留量，已在食品和饲料行业得到了广泛的应用[9]。

本文采用GICA方法对8批次牛黄震惊丸中黄曲霉毒素的残留量进行测定，采用IAC-HPLC方法对测定结果进行确认。试验通过对牛黄震惊丸样品的前处理方法进行优化，降低了样品本底对GICA方法和IAC-HPLC方法的干扰。试验对测定方法的适用性进行确认，为中药复方制剂黄曲霉毒素测定提供了技术支持。

1 仪器与试药

Waters e2695分析型高效液相色谱仪，包括Waters 2475 荧光检测器 (美国Waters公司)；光化学衍生器(美国AURA公司,反应线圈15 m，灯管254 nm)。Cloversil C18反相色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；AE 240 型十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler 公司)；Z2064 离心机(德国Hermle公司)；IAC-SEP黄曲霉毒素总量免疫亲和柱；iCheck食品安全定量快检仪；iCheck总黄曲霉毒素定量快检试剂盒(中药，产品号：CS101-J)、黄曲霉毒素混合标准品，均购自北京中检维康技术有限公司；甲醇、乙腈(美国Thermo Fisher公司，色谱纯)；样品处理及溶液配制中使用的超纯水由Mini-Q超纯水处理系统制备(美国Millipore公司)。牛黄镇惊丸及处方药材和饮片均为市售。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 混合对照溶液 精密吸取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2标示浓度分别为1.0、0.3、1.0和0.3 μgmL-1)0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

2.1.2 供试品溶液 GICA法：取牛黄镇惊丸样品(用手术剪剪碎成约2 mm3块状)，称取5.0 g于50 mL离心管中，加入70%甲醇溶液25.0 mL，置于旋转摇床上旋转振荡提取10 min，用定性滤纸过滤，即得。

HPLC法取牛黄镇惊丸样品(用手术剪剪碎成约2 mm3块状)，称取粉末样品15 g置于均质瓶中，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌2 min(11 000 r·min-1)，离心5 min(2 500 r·min-1)，精密量取上清15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀(稀释试验中，精密量取上清15 mL，置250 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀)。用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，量取续滤液20.0 mL，通过免疫亲和柱，流速3 mL·min-1，用水20 mL洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置于2 mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 检测方法 GICA法：从试剂盒中取出相应定量快检卡和黄曲霉毒素稀释缓冲液，平衡至室温，将快iCheck食品安全定量快检仪自带的零点校正片插入定量快检仪测定室，进行“零点校正”；将使用相应批次的快检卡二维码输入到iCheck食品安全定量快检仪中，获取校准曲线。将外包装打开，取出相应微孔固定于微孔架上，快检卡放置于37 ℃恒温器上。取黄曲霉毒素稀释缓冲液120 μL于相应微孔中，加入供试品溶液30 μL，用移液器吸打5次混匀，取100 μL加入快检卡样品孔中。37 ℃反应10 min后，立即将快检卡放入定量快检仪中，点击“检测分析”读数，即为样品实际浓度。

IAC-HPLC法：色谱条件：采用Cloversil C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×150 mm)，以甲醇-水(45∶55)为流动相，流速0.8 mLmin-1，检测器为荧光检测器，激发波长λex=360 nm，发射波长λem=440 nm，进样量20 μL，光化学衍生化系统为光化学衍生器 (连接于色谱柱后，然后通向荧光检测器)。

2.3 样品测定

2.3.1 GICA方法学验证及样品测定

2.3.1.1 空白对照 按处方量配置不含全蝎和炒僵蚕的牛黄震惊丸空白样品，按照“2.1.2” 项下GICA法提取，即得，空白对照在GICA方法中无黄曲霉毒素检出。

2.3.1.2 随行回收率试验 抽取3个批次样品进行方法学验证，编号为A、B和C，使用标准加入法，在供试品溶液中加入黄曲霉毒素B1标准品至终浓度分别为0、5、10、20 μg·kg-1的测试溶液。按“2.2”项下GICA法进行测定，每批次样品平行重复3次，结果见表1。其中B和C 2份样品本底有少量黄曲霉毒素B1检出，含量不高于中国药典限量。样品回收率在96.8%～130.2%之间，其余批次样品均无黄曲霉毒素检出。

表1 GICA法检测牛黄镇惊丸中黄曲霉毒素回收率试验结果(n=3)

2.3.2 IAC-HPLC方法学验证及样品测定 采用随行质量控制(包括随行空白试验和随行回收率试验)确认方法的适用性。

2.3.2.1 检测限 取混合对照溶液，进样量2 μL，计算黄曲霉毒素B1峰信噪比为10，本试验检测限为黄曲霉毒素B10.4 μg·kg-1，黄曲霉毒素总量0.4 μg·kg-1。

2.3.2.2 空白对照 按处方量配置不含全蝎和炒僵蚕的牛黄震惊丸空白样品，按照“2.1.2”项下 IAC-HPLC法提取，即得，空白对照在IAC-HPLC方法中无黄曲霉毒素检出。

2.3.2.3 随行回收率试验 将A、B和C 3批次样品，使用标准加入法，在供试品溶液中加入黄曲霉毒素B1标准品至终浓度分别为0、5、10、20 μg·kg-1的测试溶液。按“2.2”项下 IAC-HPLC法进行检测，每批次样品平行重复3次，计算黄曲霉毒素B1回收率结果见表2。3份样品回收率在46.6%～67.7%之间。所有样品未检出B1、B2、G1和G2黄曲霉毒素。

表2 IAC-HPLC方法检测牛黄镇惊丸中黄曲霉毒素回收率试验结果(n=3)

2.3.3 样品稀释的IAC-HPLC方法学验证和黄曲霉毒素检测 由“2.3.2”项下可知，采用IAC-HPLC方法对直接进样的牛黄镇静丸样品黄曲霉毒素含量进行检测，结果表明A、B和C 3份样品的回收率均较低。分析原因，可能是由于复方制剂成分复杂，本底干扰较为严重，使得测定结果回收率下降。试验中将样品进行梯度稀释，结果发现在提取样品时采用5倍稀释时，本底干扰明显降低。本节对稀释后的供试样品进行方法学研究。

2.3.3.1 检测限 结果同“2.3.2.1”项下。

2.3.3.2 空白对照 结果同“2.3.2.2” 项下。

2.3.3.3 线性关系的考察 精密吸取混合对照溶液2、4、6、8、10和20 μL，注入HPLC色谱仪，记录色谱图。以AFB1浓度(ngmL-1)为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：Y=0.656X-0.436,r2=0.998 1。AFB1在4～20 ngmL-1之间线性关系良好。

2.3.3.4 精密度试验 精密吸取同一混合对照溶液，重复进样6次，每次进样10 μL，记录色谱峰面积，精密度RSD在0.98%～1.55%之间，表明本试验仪器精密度良好。

2.3.3.5 重复性试验 取同一牛黄震惊丸样品，按供试样品溶液制备方法重复检测6次，记录色谱图，计算RSD为0.20%，表明本方法重复性良好。

2.3.3.6 回收率试验 将A、B和C 3批次样品，使用标准加入法，在供试品溶液中加入AFB1标准品至终浓度分别为0、5、10、20 μg·kg-1的测试溶液。按“2.2”项下IAC-HPLC法进行检测，每批次样品平行重复3次，计算AFB1回收率结果见表3。3份样品回收率在80.7%～94.0%之间。所有样品未检出B1、B2、G1和G2黄曲霉毒素残留。

表3 IAC-HPLC法检测牛黄镇惊丸中黄曲霉毒素回收率试验结果(×5)(n=3)

①A样品加入黄曲霉毒素B1标准品至终浓度为5 μg·kg-1；②A样品稀释后加入黄曲霉毒素B1标准品至终浓度为5 μg·kg-1；③A样品；④G1、B1、G2和B2黄曲霉毒素标准溶液图1 牛黄镇静丸中黄曲霉残留检测HPLC图

3 讨论

本试验采用了GICA和IAC-HPLC方法，对牛黄镇惊丸的黄曲霉毒素残留进行检测，仅GICA方法中检出2批次样品有黄曲霉毒素AFB1残留，且均低于试剂盒定量限(检出限：1 μgkg-1，定量限：3 μgkg-1)。8批次样品黄曲霉毒素残留量符合《中国药典》黄曲霉毒素限量规定。由于动物源性中药材全蝎和僵蚕容易感染黄曲霉，本文使用去除全蝎和僵蚕的样品作为空白对照。为了排除辅料的干扰，本文前期试验也对各种蜂蜜(包括枣花蜜、桂花蜜和白花蜜等)和炼蜜进行考察，所有蜂蜜IAC-HPLC检测无任何信号检出，表明蜂蜜对免疫胶体金反应没有干扰。

采用IAC-HPLC方法对牛黄震惊丸进行检测时发现，样品回收率较低，不能满足黄曲霉毒素残留测定的要求。分析可能的原因为牛黄震惊丸复方制剂中药原料药所含成分对IAC-HPLC测定结果有一定的干扰性。试验表明，用对牛黄震惊丸样品进行前处理中进行5倍稀释，可明显提高待测样品的回收率。采用IAC-HPLC方法检测样品，8批次样品均无黄曲霉毒素残留检出。中药复方制剂成分复杂，可能干扰测试结果，应根据不同复方制剂的特点对检测方法进行改进，并进行方法学确认。GICA方法和 IAC-HPLC方法结果基本一致，表明这两种方法在牛黄震惊丸黄曲霉毒素残留检测中结果具有可比性。