基于网络药理学探讨桑黄治疗肝炎的作用机制

丁静，吕海芹，王鹤飞，张晗，陈文文，党和勤，刘燕琳

(1.山东第一医科大学第二附属医院药剂科，山东 泰安 271000；2.山东省煤炭泰山疗养院药剂科，山东 泰安 271000)

桑黄(Phellinusigniarius)为多孔菌科，火木层孔菌的子实体。桑黄是食药两用真菌，作为中药使用始于唐代《药性论》味微苦、性寒，主要用于活血、止血、化饮、止泻。长期研究表明桑黄具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫、抗氧化等作用[1-3]。近期，有研究表明桑黄具有治疗小鼠血吸虫病肝纤维化的作用[4]。桑黄可通过抑制核因子-κB(NF-κB)的核转移，降低肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的分泌量，进而减低炎症反应[5]。然而桑黄成分复杂、相关靶点研究较少，使得深入研究面临很大困难，对肝脏疾病作用的活性成分及靶点尚未有明确研究。

网络药理学运用计算机模拟、多个数据库检索分析，通过多学科融合研究中药活性成分在人体的作用靶点，系统阐述药物作用机制，构建药物与疾病之间相互作用靶点的网络，为研究成分复杂、分子机制模糊、作用靶点较多的中草药提供新的研究思路。本文结合网络药理学，通过整合桑黄多种成分、多个靶点、多种基因，系统地分析了桑黄对肝脏炎症疾病的分子作用机制，为今后深入研究提供了理论基础。

1 材料和方法

1.1 数据库及软件 中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Phaimacology Database and Analysis Platform)；Uniprot数据库；GendCards数据库；String数据库；DAVID数据库；ClueGo软件；Cytoscape 3.7.2软件。

1.2 筛选桑黄的化学成分 本研究通过TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)中使用CancerHSP软件检索桑黄的所有化学成分。含有相关的化学成分共9种。对所有化学成分进行筛选，化合物口服生物利用度OB≥20%，共有3个化合物通过筛选，进行下一步研究。

1.3 桑黄活性成分作用靶点及肝炎疾病靶点的筛选 采用CancerHSP软件对候选化合物进行检索，得到它们对应的靶点，通过Uniprot(https：//www.uniprot.org)将靶点选为人源(human)，删除重复靶点后得到标准化基因名。

检索GendCards数据库，获得肝炎(hepatitis)的疾病靶点。将桑黄的活性成分作用靶点与肝炎疾病靶点进行比对，找出关键靶点进行后续分析。

1.4 构建桑黄化学成分-肝炎-靶点网络图 将筛选出的桑黄-肝炎有关的作用靶点基因通过Excel建立对照关系，导入Cytoscape 3.7.2，建立化合物-靶点网络图。网络图中红色节点表示疾病，黄色节点表示化合物，紫色节点表示靶点基因，相互关系以“边”表示。与疾病相连接的靶点即为桑黄-肝炎关键作用靶点，与化合物相连的边越多说明化合物作用靶点越多。

1.5 蛋白质相互作用网络图(PPI) 将桑黄-肝炎关键靶点导入String数据库(“Homo sapiens”种属)，得到蛋白质相互作用网络图，导出相关数据，使用Cytoscape 3.7.2软件构建PPI网络，通过多节点之间相互作用关系分析蛋白质之间的相互作用关系。PPI图中以“度”表示与节点有相互作用的节点数目，“度”值越大表明该节点参与生物作用越多。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路分析 通过ClueGo软件对桑黄-肝炎作用靶点基因进行GO(gene ontology)生物学过程富集和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析。GO分析是选择生物学过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)3个功能，阈值P<0.05进行分析。使用R语言对KEGG通路富集分析结果进行整理，P<0.05，列出桑黄活性成分与肝炎相关的关键通路。

2 结果

2.1 桑黄的活性成分及作用靶点 通过Lab of Systems Pharmacology网站中的CancerHSP数据库检索得到桑黄中化学成分有9种(见表1)。以口服生物利用度OB≥20%为条件对化合物进行筛选，选择其中的(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one、Phelligridin A及Phelligridin E(结构式见图1)3种作为桑黄的有效成分进行分析。

表1 桑黄中的9种化学成分详细信息

2.2 桑黄-肝炎作用靶点预测 选中的3个活性成分通过CancerHSP数据库检索得到各自对应的作用靶点，利用Uniprot数据库找出靶点对应的人源标准化基因，整合去重后共得到标准靶点基因30个。

由GeneCards数据库检索获得肝炎的疾病靶点共11 584种，将桑黄作用靶点基因与肝炎靶点基因取交集，共得到22个基因作为桑黄-肝炎预测作用靶点进行后续分析(见图2)。

2.3 桑黄有效成分-肝炎-靶点网络图 将桑黄活性成分与肝炎对应的作用靶点基因进行整理，导入Cytoscape 3.7.2作图，得到化合物-疾病-靶点基因网络图(见图3)。3个黄色中心节点为化合物节点，与中心点相连接的是各化合物对应的靶点基因(以紫色表示)。与肝炎节点(红色)连接的靶点基因即为桑黄-肝炎关键基因。由图3可以看出桑黄各化学成分与关键靶点之间的相互作用关系，3种化合物拓扑结构分析见表2，其中(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one和 Phelligridin E对应的作用靶点相对较多，说明两者在桑黄临床疗效上具有重要作用。

图1 桑黄有效成分结构式

图2 桑黄-肝炎靶点基因交集图

图3 化合物-疾病-靶点网络图

2.4 桑黄-肝炎蛋白质PPI网络分析 为更好地研究桑黄-肝炎作用机制，本研究采用String数据库，物种选择为“Homo sapiens”，导入22个关键靶点得到蛋白质相互作用网络图，将得到的结果去除一个无关联基因后导入Cytoscape 3.7.2作图(见图4)。图中每个节点代表一种靶点蛋白，节点之间连线代表两种蛋白之间有相互作用，节点颜色越近红色表明相互作用蛋白越多，节点颜色由红色-黄色-绿色逐渐过渡，相互作用节点逐渐减少。

图4 桑黄蛋白质相互作用网络图

表2 化合物拓扑结构分析表

使用Network Analyzer对网络图进行拓扑分析(见表3)，度(Degree)表示与该节点相互作用节点的数目，度值越大表明该节点参与的生物功能越多；接近中心性(betweenness centrality)和紧密度中心性(closeness centrality)是节点在整个网络中所载的中心程度。中央有6个节点的度>5，依次为：单胺氧化酶B(MAOB)、黄嘌呤脱氢酶(XDH)、乙醛脱氢酶2(ALDH2)、SMAD蛋白3(SMAD3)、乙醛脱氢酶3A1(ALDH3A1)、细胞色素P450 2A6亚型(CYP2A6)，提示这些靶点在桑黄治疗肝炎的过程中发挥了关键作用。

2.5 GO生物过程与KEGG通路富集分析 GO生物过程富集分析主要包括生物过程分析(bioligical process,BP)、分子功能分析(molecular function,MF)和细胞组成分析(cellular component，CC)，以阐述基因的生物学过程。本文采用ClueGO分析软件对桑黄-肝炎的22个关键基因进行富集分析(P<0.05),得到GO分析结果如表4。从表中看出，在生物过程(BP)中，靶点主要涉及正向调节乙醛脱氢酶[NAD(P)+]、作用于NAD或NADP醛基或氧桥基调节氧化还原酶活性正向调控两个生物过程。

表3 蛋白质网络靶点及其拓扑参数

表4 关键靶点的生物过程富集分析

KEGG通路富集结果以相关基因比例为横坐标，基因名称为纵坐标，相关基因数量以点大小表示，P值以颜色表示得到四维图(见图5)。桑黄治疗肝炎涉及糖异生/糖酵解(glycolysis/gluconeogenesis)、组氨酸代谢(histidine metabolism)、酪氨酸代谢(tyrosine metabolism)、苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)、色氨酸代谢(tryptophan metabolism)、丙氨酸代谢(beta-alanine metabolism)、药物代谢(drug metabolism)等相关信号通路，各通路涉及基因由表5可见。

图5 桑黄治疗肝炎关键靶点KEGG信号通路富集结果

表5 KEGG信号通路相关靶基因

3 讨论

桑黄是泰山地区道地药材，为食药兼用真菌，明清泰山古籍曾记载具“驱邪滋补，扶正固本”之功效。桑黄味微苦，能利五脏、软坚、排毒。桑黄化学成分研究报道较少，尤其对人体肝脏疾病作用的活性成分及靶点尚未有明确研究。为了理清桑黄的有效成分、作用靶点、分子作用机制，我们选择了网络药理学进行初步探索研究。

关于桑黄药理作用的研究较少，在常用的TCMSP数据库中查找不到桑黄相关信息，仅能在CancerHSP软件中检索到9中桑黄化学成分。其中以(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one的口服吸收度(OB=32.39%)最好。经检索，该化合物作用于多个靶点其中包括乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)，单胺氧化酶B(monoamine oxidase Type B,MAO-B)等。本研究通过对药物化学成分和疾病靶点相互作用进行网络拓扑分析，GO分析及KEGG分析，我们最终发现桑黄对肝炎作用的核心靶点在ALDH2、ALDH3A1、ALDH3B1、MAOB，对应的有效成分均为(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one。此成分主要通过乙醛脱氢酶(ALDH)发挥治疗肝炎的作用。有大量研究表明乙醛脱氢酶(ALDH)与肝脏疾病的发生密切相关[6]。ALDH家族中共有19种功能基因，是人类肝脏中氧化乙醛的关键酶，对肝脏起重要的保护作用。其中以ALDH2活性最高，ALDH2主要位于肝脏中，在心脏、肾脏、肌肉、脑组织中也有表达。在Stachowicz等[7]研究中发现ALDH2的活化可以减轻非酒精脂肪性肝炎(NASH)的发展，通过激活ALDH2增加其氧化乙醛的活性可以减少非酒精性脂肪肝、酒精引起的肝细胞坏死。有研究表明ALDH2基因缺失时可以导致酒精摄入人体后出现乙醛和糖皮质激素水平增高，抑制血清中细胞因子释放，可抑制T细胞的活化，减轻肝脏炎症[8]。

在KEGG通路富集分析中我们得到的结论是桑黄治疗肝炎的关键靶点包括组氨酸代谢(histidine metabolism)、酪氨酸代谢(tyrosine metabolism)、苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)、色氨酸代谢(tryptophan metabolism)、丙氨酸代谢(beta-alanine metabolism)、药物代谢(drug metabolism)等相关信号通路。组氨酸可减轻高脂膳食诱导的大鼠肝损伤，对肝脏细胞有一定的保护作用[9]。有研究表明络氨酸代谢异常可引起肝纤维化，FAH(fumarylacetoacetate hydrolase)基因剔除大鼠(简称Fah-/-大鼠)因为酪氨酸代谢障碍产生肝纤维化，广泛用作肝纤维化模型[10]。

综上所述，本研究通过网络药理学方法探索了桑黄主要活性成分、对肝炎作用靶点、相关生物信号通路。结果表明桑黄中(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one是治疗肝炎的有效成分，其作用机制与乙醛脱氢酶(ALDH)相关，通过多个通路发生作用。为进一步深入研究桑黄作为食药两用真菌作用机制提供依据。