双孢蘑菇液体培养基配方优化＊

查 磊，仝宗军，黄建春，李正鹏，郭 倩（上海市农业科学院食用菌研究所，上海国森生物科技有限公司，上海 201403）

双孢蘑菇(Agaricus bisporus)又称蘑菇、白蘑菇、洋蘑菇、纽扣蘑菇，味道鲜美，是一种富含氨基酸、蛋白质的低脂肪健康食材[1]。近年来，随着栽培面积的扩大和产量的增加，中国已成为双孢蘑菇生产和出口大国之一[2]，但生产方式大多比较落后，菌种扩繁时，多采用固体逐级扩大的方式，发菌时间较长，导致生产成本较高[3-5]。

而采用液体菌种接种双孢蘑菇栽培种可以有效解决这一问题。通过液体菌种接种栽培种可以提高双孢蘑菇栽培菌种菌丝的生长速度，提高菌龄的一致性，对双孢蘑菇菌种生产具有重要意义，可促进中国双孢蘑菇的生产向高质量、标准化、周年化、工厂化的生产方向发展[6]。基于以上原因，笔者对双孢蘑菇液体菌种进行研究，以期为双孢蘑菇菌种生产提供技术依据。

材料与方法

培养基的优化

以生产常用的液体菌种配方（黄豆粉4 g、蔗糖20 g、K H2P O41 g、硫酸镁0.5 g、水1 L）作为基准配方，进行优化。

培养时间

以基准配方作为实验配方，制作液体菌种，在500 mL的三角瓶中分装250 mL 培养基，进行121℃、30 min 灭菌，待冷却后，接种3 mm 菌块10块，在25 ℃、150 r/min 的摇床中进行培养，对液体菌种生长过程中第8～24 天菌丝干重的变化情况进行了记录。

菌丝干重的称量方法

滤纸烘干至恒质量称量，记为m1，取培养好的液体菌种，真空泵抽滤，得到菌丝体，菌丝体与滤纸烘干至恒质量称量，记为m2，即菌丝干重为m2-m1。

菌丝湿重的称量方法

取培养好的液体菌种，进行过滤，将过滤得到的菌丝体3000 r/min 离心，弃上清，对菌丝湿重进行称重，即为菌丝湿重。

适宜pH 筛选

对液体菌种的适宜pH进行确定，通过K2HPO4和KH2PO4作为缓冲剂对双孢蘑菇液体菌种的pH 进行调整。K2HPO4和KH2PO4的的添加量如表1。并对其灭菌前后的进行了pH、菌丝干重以及菌丝形态进行了记录。

表1 培养基K2HPO4 和KH2PO4 的添加量/（g/L）

适宜碳源筛选

对液体菌种的适宜碳源进行筛选，选择蔗糖、红糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、甘露醇、海藻糖、乳糖、山梨醇、果糖作为糖源进行筛选，并依据干重和外观形态对菌丝状态做出评价。

图1 不同培养时间菌丝干重的变化情况

适宜氮源筛选

对液体菌种的适宜氮源进行筛选，选择有机氮源、无机氮源（硝态氮和铵态氮）作为氮源进行筛选，并依据干重和外观形态对菌丝状态做出评价。

氮源的复配

氮源是菌丝生长的重要营养，复合氮源在生产上较为常用，以玉米粉和黄豆粉作为材料对氮源进行复配，复配情况如表2，故主要以菌丝干重作为评判依据。

发酵罐发酵

根据筛选的结果选择黄豆粉2 g、玉米粉2 g、蔗糖20 g、K2HPO41 g、硫酸镁0.5 g、水1 L 作为最终配方，进行发酵罐发酵（6 L），接种量为250 mL，通气量为4 L/min，培养温度为25 ℃，培养12 天。对培养好的液体菌种进行过滤，对所得菌丝体进行3000 r/min 离心，弃上清，对菌丝湿重进行称重。

表2 培养基玉米粉和黄豆粉的添加量/（g/L）

结果与分析

培养时间

对菌丝干重随培养时间（8～24 天）延长的变化进行了研究，并对不同培养时间的干重进行多重比较。从结果（图1）可以看出在第9～16 天菌丝干重较大，且无显著差异（P＜0.05），在第12 天达到最大值，16 天后菌丝干重开始减少。因此，根据干重的最大值选择以12 天作为菌丝培养的最佳时间。

pH

试验结果表明随着K2HPO4增加、KH2PO4的减少，pH 逐渐增大，且灭菌前后pH 无较大变化（图2a），但各个pH 梯度间存在显著差异。结合干重（图2b）的结果，配方U 显著高于其他配方，结合外观形态（图2c） 的变化情况，配方U 菌丝浓密，故选择不添加K2HPO4、添加1 g KH2PO4。

碳源

试验结果表明，蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、果糖作为糖源菌丝干重（图3）显著高于其他碳源（P＜0.05），均可作为生产配方的碳源，但根据外观形态（图3）结果可以看出，葡萄糖作为碳源的菌丝产生沉淀，且颗粒大，故蔗糖、可溶性淀粉、果糖作为备选碳源，考虑到蔗糖较为廉价，且生产效果上与可溶性淀粉、果糖无明显差别，故选择蔗糖作为碳源。

氮源

试验结果表明，黄豆粉、麸皮粉、玉米粉作为氮源菌丝干重显著高于其他氮源（P＜0.05），均可作为氮源，但根据外观形态（图4）结果可以看出，麸皮粉作为氮源菌丝产生沉淀较黄豆粉和玉米粉较差，且颗粒大，故黄豆粉、玉米粉作为备选氮源。

氮源的复配

图2 不同pH 处理菌丝干重和外观的变化情况

图3 不同碳源干重、菌丝形态情况

图4 不同氮源干重、菌丝形态情况

试验结果表明，以玉米粉和黄豆粉作为氮源对其进行复配，其菌丝生长状况基本一致，故主要以菌丝干重（图5）作为评判依据。虽然配方A、C、D、E 间无显著差异，但配方C菌丝干重量最大，故选择配方C 的氮源作为筛选氮源，氮源确定为玉米粉2 g，黄豆粉2 g。

发酵罐实验

使用优化后的配方进行发酵实验，可以较好地发酵双孢蘑菇液体菌种，发酵好的菌种菌球大小均匀，且菌球密度大，6 L 的发酵液可以获得湿重480 g 的菌丝，且液体菌种发酵的稳定性更好，菌丝发酵情况如图6。

结论与讨论

先进的制种技术对中国食用菌的生产和国际贸易具有重要影响。液体菌种因其培养周期短、菌丝体生长条件相同、菌龄一致、出菇整齐、现蕾快、成本低、纯度高、活性强等优点，有利于高效率、工厂化、规模化栽培[7]，双孢蘑菇液体菌种的研究可以为双孢蘑菇栽培种的生产提供技术支持。

数据表明，菌丝干重随着培养时间的延长，基本呈现先上升后下降的趋势，这与红平菇[8]、木蹄层孔菌[9]、美味牛肝菌[10]的研究结果具有一致性，这可能是由于食用菌菌种接种液体培养基，适应了液体培养基后，菌丝生长速度加快，因此菌丝的生物量上升；但当液体培养基内的菌丝量达到最大值后，随着培养基内营养物质的消耗，当培养基内因营养物质消耗过多而不能维持细胞增加与死亡的平衡时，发酵液内的菌丝便进入衰亡期[11]。另外，pH 保持在中性偏碱的时候最适合菌丝生长，这与双孢蘑菇培养料的最适pH 基本一致。同时，在木腐菌栽培过程中，玉米粉，黄豆粉作为工厂化生产液体菌种的主要原材料[7]，为双孢蘑菇液体菌种工厂化生产奠定基础。

图5 菌丝干重情况

图6 菌丝发酵状况

试验在原有木腐菌配方的基础上，对双孢蘑菇的培养时间、pH、碳氮源进行了优化，根据试验结果选择黄豆粉2 g、玉米粉2 g、蔗糖20 g、K2HPO41 g、硫酸镁0.5 g、水1 L作为最终配方，培养时间选择为12 天。