大鼠carabin腺病毒干扰载体构建及功能鉴定

程阔菊，吴 庆，罗健华，魏谭军，周殿儒，肖 成,黄 河，罗 云，王 毅

carabin是2007年在人T细胞中发现的一个新的钙调磷酸酶(calcineurin，CaN)结合蛋白，主要表达于脾脏及血液中[1]，同时可与Ras结合，基于其与CaN和Ras均能相互作用的特性，将其命名为carabin[1]。前期研究[1-4]表明，carabin作为CaN的内源性负反馈抑制蛋白，通过CaN和Ras信号通路负反馈抑制T细胞及B细胞的持续活化，在机体免疫中发挥着重要作用。最近研究[5-6]表明，carabin在心肌细胞中亦有表达，可通过负性调节CaN和Ras信号通路抑制心肌细胞的肥大，并有可能成为诊治心衰引起心肌肥厚的靶点。我们的前期研究[7]发现，carabin在小鼠梗死心脏及经缺血/缺氧处理的人心室肌细胞株AC16中表达均显著下调，提示carabin在心肌梗死及缺血中可能起到一定的作用，但目前尚无相关研究报道。本研究拟采用腺病毒载体系统，设计针对大鼠carabin基因的干扰序列，构建carabin腺病毒干扰载体(Ad-carabin-shRNA)，感染H9C2心肌细胞筛选针对大鼠carabin基因干扰效果最佳的Ad-carabin-shRNA，为进一步观察carabin信号通路在心肌梗死及缺血中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及载体质粒 细胞株293A、293T及H9C2购自中国科学院细胞库，ADV4-U6-CMV重组穿梭质粒和pGp-Ad-pac载体骨架质粒购自吉玛基因。

1.1.2 主要试剂与仪器 RNA引物合成及DNA测序(美国，Invitrogen公司)。限制性内切酶EcoRI(NEB，R0101M)、BamHⅠ(NEB，R0136S)，T4 DNA连接酶(NEB，M0202L)，RNAi-Mate转染试剂(吉玛基因，G04001)，Polybrene(Sigma，H9268)、carabin抗体(Abcam，ab77625)、β-actin抗体(Abcam，ab115777)、山羊抗兔IgG(碧云天，WSA0208)。二氧化碳培养箱(SANYO，MCO-15AC)，生物安全柜(上海上净净化设备有限公司，BSC-ⅡA2)，荧光显微镜(Motic，AE31-252B)。

1.1.3 引物设计及合成 针对大鼠carabin基因，设计3对carabin-shRNA寡核苷酸序列(carabin-shRNA-1：5′-GAC CTT ACA CTG GGA GAA GAC-3′；carabin-shRNA-2：5′-GTC TAC CTC CCT GGC TAC TAT-3′；carabin-shRNA-3：5′- AGC TGC AGG AAG AGG TCT TCA -3′)，分别插入ADV4-U6-CMV穿梭质粒的EcoRⅠ与BamHⅠ酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成3对寡核苷酸，规格为2A。

1.2 方法

1.2.1 ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA重组穿梭干扰质粒的构建及筛选 将3对carabin-shRNA寡核苷酸退火形成双链，EcoRⅠ与BamHⅠ酶切寡核苷酸和ADV4-U6-CMV穿梭质粒，T4 DNA连接酶连接酶切后的寡核苷酸和ADV4-U6-CMV穿梭质粒。将3组连接产物转化至DH5a化学感受态细胞，接种于含氨苄西林的培养基平板，次日挑选阳性单克隆菌群，药液培养过夜，菌液送上海生工生物测序，将序列无误的质粒分别命名为ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-1、ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-2、ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-3。

1.2.2 AD-carabin-shRNA包装、收毒及扩增 将制备的ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA腺病毒穿梭质粒与pGp-Ad-pac载体骨架质粒经高纯度无内毒素抽提后，用转染试剂RNAi-Mate进行共转染293A细胞，转染后6 h更换为完全培养基，培养2周，每7 d左右补充一次新鲜培养基，然后收集细胞和上清液置于离心管中，冻融3次，2 000 r/min离心5 min，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后对其纯化和浓缩后得到高滴度的腺病毒浓缩液。

1.2.3 AD-carabin-shRNA滴度测定 参考复旦大学遗传学研究所方法[8]，在293T细胞中测定并标定病毒滴度，采用微量全细胞病变法检测病毒滴度。取96孔板，每孔加入0.5×104～1×104293T细胞，48 h后弃去培养液，每孔加入100 μL经10倍梯度稀释的病毒液(每排8孔为一稀释梯度)，继续培养72 h后观察荧光表达情况。正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少，计数最后2排含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数，将得到的数值除以各自相应的稀释倍数，即可计算出病毒原液的滴度值。病毒滴度=(X+Y×10)×1 000/2V (X、Y分别为最后两排有荧光的荧光细胞克隆数，V为病毒液的含量)。

1.2.4 AD-carabin-shRNA功能鉴定 H9C2心肌细胞传代至108时接种于6孔板中，当细胞生长至90%融合时，每孔加入含1×105病毒的100 μL病毒液，孵育4 h后更换培养基，44 h后检测H9C2心肌细胞的carabin RNA及蛋白表达。采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测carabin mRNA和蛋白表达。其中3孔弃去培养液后，每孔按1 mL/10 cm2加入分离试剂tripure isolation reagent，按照说明书提取总RNA，接着按照Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转成cDNA，然后用LightCycler 480 PCR仪对carabin进行实时荧光定量PCR扩增。扩增条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 10 s～60 ℃ 10 s(荧光检测)，40个循环。carabin引物序列，上游引物：5′-GGT GCA GCA AGG AGC CTG-3′，下游引物：5′-TGA GTC GGA CCC TAG AGA GC-3′，产物长度118 bp。内参β-actin引物序列，上游引物：5′-GGA GCA ATG ATC TTG AT-3′，下游引物：5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT C-3′，产物长度202 bp。另外3孔弃去培养液后，每孔加入500 μL细胞裂解液RIPA，超声裂解细胞收集蛋白，加入SDS煮沸变性蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳、转膜、孵育一抗、孵育二抗、显色、成像，观察carabin蛋白表达，内参为β-actin。

1.3 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA重组穿梭干扰质粒的构建 DNAMAN比对分析ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA重组穿梭干扰质粒的基因测序结果，挑选与设计的3对carabin-shRNA寡核苷酸序列一致者，分别命名为ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-1、ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-2、ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-3(见图1)。

2.2 Ad-carabin-shRNA包装、收毒、扩增及滴度测定 将制备的ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA腺病毒穿梭质粒与pGp-Ad-pac 载体骨架质粒共转染293A 细胞后，2周左右时显微镜下观察细胞出毒情况，待出现明显噬斑、细胞大部分病变从底部脱落时进行收毒。采用微量全细胞病变法检测病毒滴度，以倒数第二列(10-3)含有荧光细胞孔中的荧光细胞个数计算，病毒滴度为9×108TU/mL(见图2)。

2.3 Ad-carabin-shRNA功能鉴定 与对照组相比，Ad-carabin-shRNA-1和Ad-carabin-shRNA-2均可明显干扰carabin mRNA及蛋白表达(P<0.01)(见图3、表1)。

3 讨论

经结构鉴定，carabin蛋白含有一个CaN 结合区域和一个Ras结合区域：CaN结合区域位于羧基端，其最小结合区域为羧基末端的41个氨基酸残基(aa 406～446)；Ras结合区域为氨基端的89位到294位氨基酸序(aa 89～294)[1]。经在体和离体实验的功能鉴定：(1)CaN 结合区域，carabin的转录和表达依赖于CaN信号通路的活化，而产生的carabin可与CaN结合，进而抑制CaN信号通路，因此carabin是作为CaN的负反馈抑制蛋白来发挥其调节作用的；(2)Ras结合区域，具有Ras GAP活性，可特异性地抑制Ras/ERK1/2信号通路。前期研究[1-4]表明，在T细胞及B细胞中carabin作为CaN的内源性负反馈抑制蛋白通过CaN-NFAT和Ras/ERK1/2信号通路负反馈抑制T细胞及B细胞的持续活化，在机体免疫中发挥着重要作用。

表1 Ad-carabin-shRNA在H9C2心肌细胞内的干扰效应

最近研究[5-6]表明，carabin在心肌细胞中亦有表达，可抑制心脏肥厚，并有可能成为诊治心衰的新靶点。我们的前期研究[7]显示，在小鼠冠状动脉左前降支结扎诱导的心肌梗死动物模型中，术后7 d及14 d梗死区域carabin的mRNA及蛋白表达水平均显著下调(约7倍)，同时经缺血/缺氧处理的人心室肌细胞株AC16中表达均亦显著下调。那么下调的carabin在心肌梗死中是否会起到一定的作用呢，目前尚无相关研究报道。 carabin为一新发现的蛋白，目前尚未发现其特异性抑制剂，鉴于此，本研究利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，针对carabin蛋白构建相应干扰载体，以达到特异性抑制carabin的作用，为carabin的研究奠定基础。

RNAi技术是一种由外源性或内源性双链DNA介导的转绿后基因沉默技术。短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)是根据小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术设计的类似双链结构的RNA。相比于siRNA，shRNA随载体进入细胞后具有更高的内在稳定性，并且shRNA根据其特性可以在细胞内快速合成大量的shRNA，其沉默作用更加持久[9]。目前，用于目的基因转移的病毒载体主要包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒载体。与其他病毒载体系统相比，腺病毒载体具有遗传毒性低、不整合基因组、寄主范围广、感染效率高、可感染分裂期和静止期细胞、理化性质稳定及包容量大等优点，在分子生物学领域应用广泛[10]。因考虑后期研究涉及动物及细胞实验，对干扰效率要求高，因此本研究采用腺病毒载体构建carabin干扰载体。

在Ad-carabin-shRNA 构建过程中，我们首先合成3对carabin-shRNA寡核苷酸，退火形成双链后定向克隆至ADV4-U6-CMV穿梭质粒，经测序验证后与pGp-Ad-pac Vector骨架质粒共转染 293A 细胞，培养2周后收集病毒原液，再连续三代反复行病毒扩增。病毒滴度测定后，感染H9C2心肌细胞行Ad-carabin-shRNA功能鉴定，鉴定结果表明，AD-carabin-shRNA-1和AD-carabin-shRNA-2具有干扰效果。